一、實驗目的
(一)熟悉姊妹染色單體交換的基本原理。
(二)熟悉姊妹染色單體交換的製備方法及觀察。
二、實驗材料
(一)物件：人體外周血、姊妹染色單體交換玻片標本。
(二)器材：超淨工作臺、離心機、恆溫水浴箱、恆溫箱；5mL刻度離心管、吸管、30mL圓形培養瓶、注射器；解剖器、載玻片、培養皿、試管架、30W紫外線燈、吸水紙、黑紙等。
(三) 試劑: RPMI 1640、Brdu、肝素液、小牛血清、植物血凝素、青黴素、鏈黴素、秋水仙素、無水乙醇、乙醚、香柏油、甲醇、冰乙酸、氯化鉀、氯化鈉、枸櫞酸鈉、Giemsa染液、NaH₂PO₄。
三、實驗原理
姊妹染色單體交換(sister chromatid exchange，SCE) 是指一染色體的兩條姊妹染色單體之間同源片段的交換。它是表示染色體複製過程中DNA雙鏈的等位點交換。因此，它能敏感地顯示DNA的損傷。
在DNA複製過程中，5-溴脫氧尿嘧啶核苷 (5-Bromo-2-deoxy-Uridine，Brdu) 能作為核苷酸前體摻入到新合成的DNA中，取代胸腺嘧啶核苷(TdR)的位置。細胞在含有Brdu的培養基中經歷兩個細胞週期之後，其兩條姊妹染色單體的DNA雙鏈在化學組成上就有了差別。第一次分裂時，其中期染色體的兩條姊妹染色單體的DNA鏈，一股是原來的模板鏈，一股是含有Brdu的新鏈，它們在染色時，兩條姊妹染色單體著色相同。當細胞進行第二次分裂時，中期染色體的兩條姊妹染色單體：一條單體的DNA 雙鏈只有一股含有Brdu，另一股則是原來的模板鏈；另一條單體則是雙股都含有Brdu。這種雙股都含有Brdu的DNA鏈組成的染色單體，螺旋化程度較低，在熱鹽溶液中受光的照射後更易於水解，因而這條染色單體對Giemsa染料的親和力降低。故用Giemsa染液染色時，可清楚看到雙股都含有Brdu的DNA鏈所組成的單體著色淺，而僅單股含Brdu的DNA 鏈所組成的單體著色較深。這樣，就能觀察到兩條明暗不同的染色單體，可利用這一姊妹染色單體分化染色技術，檢查細胞中姊妹染色單體交換的情況。
姊妹染色單體分化染色法為研究染色體半保留複製、染色體的分子結構與畸變以及DNA複製、DNA損傷修復及癌變等提供了有效的手段。
四、實驗步驟
1.細胞培養和製片
(1)培養液的配製分裝及無菌操作技術與人類染色體標本製備相同。
(2)血細胞培養：按常規採血、接種，進行外周血淋巴細胞培養。在培養24小時後按無菌操作加入Brdu，其最終濃度為10ug\/mL培養液。置黑暗處（將培養瓶用黑紙、黑布包裹或放在特製黑色木盒中)。繼續培養48小時。終止培養前2小時加入秋水仙素，其最終濃度μg\/mL培養液。
(3)製片：按染色體標本製備方法收穫細胞及製片。
2.後處理（分化染色）：
方法一，紫外線照射法：
染色體標本在37℃至少乾燥24小時，將標本置培養皿中，上蓋擦鏡紙，滴加適量2×SSC溶液後，置60℃恆溫水浴箱溫育，同時用30W紫外燈垂直照射15~20分鐘，照射距離6cm，照射完畢用自來水沖洗玻片，常規Giemsa染色5~8分鐘，再用自來水沖洗，室溫下乾燥。
方法二，熱鹽溶液處理：
將已制好的標本置37℃溫箱中乾燥24小時，取出後放入預熱至85℃~89℃的1mol\/L NaH₂SO₄溶液中（用前以1mol\/LNaOH將pH調至）處理15分鐘，取出後，用蒸餾水輕輕漂洗2~3次，晾乾，用Giemsa染液染色5~10分鐘，自來水沖洗，室溫下乾燥。
五、注意事項
(1)以上方法要獲得成功，最基本的條件是要製得高質量的染色體標本，特別是要有足夠數量的第二代分裂細胞，染色體分散好，鋪展平，胞漿要除盡。
(2)用方法一處理時，紫外線照射期間標本上的2×SSC溶液不能完全蒸乾，否則影響效果。
(3)用方法二處理時，標本溫育時間與老化時間的長短有關。老化時間越長，溫育時間也要延長。玻片要特別乾淨，否則在熱溶液中處理會出現細胞脫落現象。
(4)Brdu可在開始培養時加入，亦可培養24小時後加入。Brdu是一種強突變劑，使用濃度不宜太高，否則會產生細胞毒性，一般採用5μg\/mL、10μg\/mL及20μg\/mL。
六、實驗結果
選擇Brdu摻入後第二個細胞週期，染色體分散良好，姊妹染色單體分色清晰、含有46條染色體的中期分裂相。可以看到兩條姊妹染色單體著色顯著不同，一條染色深，一條染色淺，並能看到有的姊妹染色單體發生了交換。在統計時，如交換髮生在染色體端部，則算為一次交換，如交換片段發生在染色體中部則計為兩次交換。在計數30個以上中期分裂相的SCE以後，計算每個細胞的SCE平均值(SCE數\/細胞數)，即為該個體的SCE頻率。如被檢查者有某種疾病，或經常接觸有害物質，或採用正常人的血液，但在培養過程中加入了誘變劑，則交換頻率會大大增加。
七、作業與思考題
(一)作業
計數10個以上中期分裂相的SCE數，計算SCE平均值。
(二)思考題
的原理是什麼？
有何意義？
附錄 試劑配製
(一)500μg\/mL Brdu液的配製：用萬分之一的分析天平稱取Brdu粉末2mg，置乾淨無菌的青黴素瓶中，按無菌操作加入無菌生理鹽水4ml(其濃度為500μg\/ml)，用黑紙包好避光，置4℃冰箱儲存備用。
(二)2×SSC溶液的配製：稱取氯化鈉、檸檬酸鈉，用蒸餾水溶解後，加蒸餾水至1000mL，儲存備用。