一、實驗目的
(一)學習動物細胞原代培養的一般方法與步驟。學習培養細胞的觀察方法。
(二)掌握無菌操作技術。
二、實驗材料
(一)物件：孕鼠或新生乳鼠。
(二)器材：超淨工作臺，眼科剪，眼科鑷，平皿，試管，培養方瓶，滴管，橡皮頭，橡皮塞，恆溫箱，倒置顯微鏡。
(三) 試劑：RPMI 1640，小牛血清，青黴素、鏈黴素溶液100單位\/mL，%胰酶溶液，Hank's液，75%乙醇。
三、實驗原理
細胞培養是把生物體內的細胞取出，模擬體內生理環境，在無菌、適當溫度和一定營養條件下，使其生存、生長、繁殖，藉以觀察研究細胞的各種生命現象。
細胞培養可分為原代培養和傳代培養。原代培養是指直接從有機體獲取細胞立即進行培養。任何動物細胞的培養均需從原代細胞培養做起。動物很多組織的細胞，如動物的腎、肺、卵巢、精巢等組織的細胞較易培養，而神經細胞等較難培養。培養細胞能顯示出來源組織的分化特徵，如心肌共搏等。
四、實驗步驟
在操作之前，各種用品需嚴格消毒，以保證清潔無菌，超淨工作臺需紫外線照射20~30分鐘。操作者需用肥皂洗淨手，並用75%乙醇擦拭。整個操作過程應在超淨工作臺內酒精燈火焰旁進行，以減少汙染的可能性。
1.取材：取新生乳鼠一隻，浸入75%乙醇中浸泡5秒鐘左右，攜入超淨工作臺內，置於消毒培養皿中，用Hank’s液洗滌2次，再剖開胸腹腔，剪取黃豆大小的肺、腎、心、肝、面板等組織，分別置於無菌平皿中。
2.清洗：用含雙抗的Hank’s液洗滌2次，並剔除脂肪、血液等。
3.剪下：組織塊移入無菌短試管或青黴素瓶中，用眼科剪將組織塊剪成1mm³大小的碎塊，再用Hank’s液洗滌2次，自然沉澱，棄去帶血的上清液。
4.消化：加入%胰蛋白酶液，消化5~10分鐘, 吸去消化液，用Hank's液洗1次，再用培養液洗1次。
5.接種：用吸管將組織塊吸入方形培養瓶內，均勻分散於底壁上，將此面(有標本的面)朝上，加入2~3mL培養液，塞好瓶塞，做好標記，置37℃溫箱中培養。
6.培養：4~5 小時後將培養瓶翻轉，使有標本的瓶底壁朝下，使培養液浸泡組織塊，繼續置37℃溫箱中培養。
五、實驗結果
組織塊培養2~3天后開始，每天小心取出培養瓶置於倒置顯微鏡下進行觀察，一般最先“長出”的是形態不規則的遊走細胞，接著“長”出成纖維細胞或上皮細胞，後逐漸出現細胞分裂，細胞數量增多，在組織塊周圍形成較大生長暈，隨之細胞生長較快，可根據培養液顏色變化，補加或更換培養液。如細胞生長良好，10~15 天可長成緻密單層，這時可進行傳代培養。
六、作業與思考題
(一)簡述細胞原代培養法的主要步驟。
(二)在細胞培養中怎樣防止汙染?
附錄 試劑配製
%酚紅液的配製：稱酚紅置於研缽中研碎，逐漸加入濃度為\/L的NaOH並不斷研磨，直到所有的顆粒幾乎完全溶解，最後加入濃度為\/L的 NaOH 液的量為，然後倒入溶量瓶中，並加入三蒸水至100mL，棕色瓶儲存備用。
%NaHCO₃液的配製：稱取NaHCO₃加三蒸水至100mL， 倒入鹽水瓶中，以9磅(4086g)10分鐘高壓蒸汽滅菌，儲存於4℃冰箱中。
3. Hank’s 溶液的配製:
(1)原液甲：
氯化鈉 (NaCl) 80g，氯化鉀(KCl) 4g，硫酸鎂(MgSO₄⋅7H₂O)1g，氯化鎂(MgCl₂⋅6H₂O)1g，氯化鈣(CaCl₂)
將氯化鈣溶於50mL 三蒸水中，其他依次溶於100mL三蒸水中，兩液混合，加三蒸水至500mL 加氯仿儲存於4℃冰箱中。
(2)原液乙：
磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄⋅12H₂O)，磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)，葡萄糖 10g，%酚紅液50mL
依次溶於400mL三蒸水中，加入酚紅液，加三蒸水至500mL，加入氯仿，儲存於4°C冰箱中。
(3)使用液：
取原液甲25mL，原液乙25mL，加入已預先滅菌的三蒸水至500mL。分別裝入鹽水瓶中，以9磅(4086g)高壓蒸汽滅菌10分鐘，冷卻後，置4℃冰箱中儲存，使用前以%的NaHCO₃液調節pH。