一、血清蛋白質醋酸纖維薄膜電泳
（一）實驗目的
掌握血清蛋白質醋酸纖膜電泳的基本原理、操作方法及測定的臨床意義。
（二）實驗原理
帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極移動，稱為電體(electrophoresis，簡稱EP)。血清中各種蛋白質的等電點大多低於。在巴比妥緩衝液中電離成負離子，在電場中向正極移動。由於血清中各種蛋白質的等電點不同。在同一下所帶電荷量不同。此外各種白質的分子量大小與分子形狀也不同，因而在電場中的泳動速度不同。一般說來，蛋白質分子帶的靜電荷量越多，分子量越小，分子呈球型，則泳動速度快。反之則慢，因此可以利用其速度快慢的不同將之分開。
醋酸纖維薄膜電泳(cellulose acetate membrane electrophoresis)以醋酸纖維薄膜為支援物，依上述原理將血清蛋白質分離為白蛋白、α₁-球蛋白、α₂-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白五個區帶。（由正極向負極方向）
待蛋白分離後，用染色劑染色，蛋白質的量與結合的染量成正比，故可將各蛋白質區帶剪下，分別用 mol\/LNaOH浸洗下來，用來比色測定其相對含量，也可以將染色後的薄膜直接用光密度計測定其相對含量。
（三）實驗試劑
1.巴比妥緩衝液(,a＝)：稱取巴比妥鈉,巴比要,用蒸餾水稀釋至1000ml。
2.氨基黑10B染色液：取氨基黑。加冰醋酸10ml及甲醇50ml，混勻後用蒸餾水稀釋至100ml。
3.漂洗液：取95%乙醇45ml,加冰酸5ml混勻，用蒸餾水稀釋至100ml。
4. 浸出液: \/LNaOH。
（四）實驗器材
電泳儀，電泳槽，鑷子，鉛筆，尺子，洗脫缸等。
（五）實驗操作
1. 點樣
(1)取醋酸纖維薄膜小條(2cm×8cm)，在薄膜無光澤面距一端處用鉛筆畫一線，作為點樣位置。然後將薄膜浸入巴比妥緩衝液中，待完全浸透後(指薄膜上無白色斑痕)取出，用濾紙吸去多餘緩衝液。
(2)用蓋玻片蘸新鮮血清，印在點樣線上，待血清完全滲入薄膜後移開。
2.電泳：將點樣後的薄膜條置於電泳槽架上，點樣面朝下，點樣端置於負極，在薄膜兩端分別搭上數層濾紙(2~4層) 連線緩衝液。薄膜條與濾紙需貼緊，平衡約5min後，以電壓為90~120V、電流為~\/cm膜寬，通電45~60min，待電泳區帶展開25~35mm後關閉電源。
3.染色：用鑷子將電泳後的薄膜取出，直接浸入盛有氨基黑10B染色液的器皿中， 染色3~5min。
4.浸洗：將漂洗液盛裝於3個玻璃皿中，將薄膜浸入第一皿，依次轉入第二皿、第三皿，在每皿中浸3~5min，直到背景無色、區帶清晰為止，最後在清水中浸洗1次，取出晾乾，辨認圖譜中各蛋白質區帶。
5.定量
(1)洗脫比色法：將電泳染色漂洗後的薄膜，按分離的各種蛋白質區帶分別剪下，另取一條與區帶近似寬度的無蛋白附著的空白薄膜，將各膜分別置於\/LNaOH溶液中，時時搖動約30min，使藍色洗脫。
在波長620nm下測吸光度，以空白管作對照，調吸光度零點，測出各管的吸光度，按下述方法計算出血清各部分蛋白質所佔的百分率。
先計算吸光度總和(T)：T=A+α₁+α₂+β+γ。然後計算各部分蛋白質的百分數：白蛋白( % )= A\/T×100％，依次計算α₁、α₂、β、γ各蛋白質的百分數。
(2)光明電極掃描法：經電泳、染色、漂洗後乾燥的薄膜浸入透明液中(冰醋酸：95%乙醇=2：8)，20min後取出，貼在乾淨的玻璃板上，乾燥過程中薄膜變透明，用光密度計掃描電泳薄膜上的各區帶吸光度，繪出距離-吸光度曲線，從曲線下每個峰的面積可計算出各區帶蛋白質佔血清總蛋白質的百分含量。
（六）臨床意義
血清中的蛋白質的種類很多，除一部分球蛋白在網狀內皮細胞合成外、其餘大部分在肝臟合成。在正常情況下，血清中蛋白質濃度在一定範圍內波動，在某些病理情況下，血清蛋白質的含量和比例會發生改變。患腎病綜合徵及腎炎者，血清蛋白可以從尿中丟失，導致血清蛋白含量降低。在嚴重營養不良情況下，由於合成原料不足，血清蛋白的含量也可以降低。在慢性肝炎和肝硬化病人中，除由於血清蛋白合成功能低下而造成的血清蛋白含量下降外，還可見到γ-球蛋白含量升高。因此測定血清蛋白質的含量有一定的臨床意義。
正常值：白蛋白：57%~72%，α₁-球蛋白：2%~5%，α₂-球蛋白：4%~9%，β-球蛋白：%~12%，γ-球蛋白：12%~20%。
（七）注意事項
1.電泳圖譜不齊：點樣時血清滴加不均。
2.電泳圖譜出現條痕：點樣後薄膜過幹，或由於電泳槽密閉性不良，或電流過大造成水分蒸發薄膜乾燥。
3.分離不良：標本滴加過多。
4.區帶過於緊密：緩衝液離子強度大於。
5.區帶拖尾：緩衝液離子強度小於。
6.染色後血清蛋白中間色淺：染色時間不足，或血清蛋白分量過高，此時可減少檢樣用量或延長染色時間。
7.γ-球蛋白向反方向移動電滲現象，可升高點樣端的緩衝液面高度或適當加大電流量克服之。
8.透明時若膜不幹或透明液中醋酸含量不足即發白，不能完全透明；若透明液中醋酸含量過高，或室溫過高，可使膜溶解，此時可酌情減少醋酸含量。
（八）思考題
為什麼要將血清樣品點在薄膜條的負極端？
二、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離蛋白質
（一）實驗目的
1.強化學生對電泳基本原理的理解與記憶。
2.熟記聚丙烯醯胺凝膠電泳分離蛋白質的基本原理並學會操作。
3.與醋酸纖維素薄膜電泳比較，瞭解聚丙烯醯胺凝膠電泳分離蛋白質的優點。
（二）實驗原理
聚丙烯醯胺凝膠(PAG) 是一種人工合成的凝膠，它是由丙烯醯胺(Acr) 和交聯劑亞甲基雙丙烯醯胺(Bis)在催化劑作用下，聚合交聯而成的含有醯胺基側鏈的脂肪族大分子化合物。聚合反應常用的催化劑有過硫酸銨及核黃素。為了加速聚合，在合成凝膠時還加入四甲基乙二胺作為加速劑。聚丙烯醯胺凝膠具有網狀立體結構，且可透過控制Acr的濃度或Acr與Bis的比例合成不同孔徑的凝膠，以適用於分子大小不同的物質的分離，還可以結合解離劑十二烷基磺酸鈉以測定蛋白質亞基分子量。
根據凝膠各部分緩衝液的種類及pH值及孔徑大小是否相同，可分為連續系統和不連續系統聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)。在連續系統中，各部分均相同，在不連續系統則不同。不連續系統的優點在於：對樣品的濃縮效應好，能在樣品分離前就將樣品濃縮成極薄的區帶，從而提高解析度。若樣品濃度大、成分簡單時，用連續系統也可得到滿意的分離效果。不連續系統的聚丙烯醯胺凝膠電泳具有較高的解析度，主要是由於其具有濃縮效應、電荷效應和分子篩效應。
1. 濃縮效應：凝膠由兩種不同的凝膠層組成。上層為濃縮膠，下層為分離膠。濃縮膠為大孔膠，緩衝液，分離膠為小孔膠，緩衝液。在上下電泳槽內充以Tris-甘氨酸緩衝液()，這樣便形成了凝膠孔徑和緩衝液pH值的不連續性。在濃縮膠中 HCl幾乎全部解離為Cl⁻，但只有極少部分甘氨酸解離為H₂NCH₂COO⁻。蛋白質的等電點一般在pH5左右，在此條件下其解離度在HCl和甘氨酸之間。當電泳系統通電後，這3種離子同向陽極移動。其有效泳動率依次為：Cl⁻＞蛋白質＞H₂NCH₂COO⁻,故Cl⁻稱為快離子，而H₂NCH₂COO⁻稱為慢離子。電泳開始後，快離子在前，在它後面形成一離子濃度低的區域即低電導區。電導與電壓梯度成反比，所以低電導區有較高的電壓梯度。這種高電壓梯度使蛋白質和慢離子在快離子後面加速移動。在快離子和慢離子之間形成一個穩定而不斷向陽極移動的介面。由於蛋白質的有效移動率恰好介於快慢離子之間，因此蛋白質離子就集聚在快慢離子之間被濃縮成一狹窄帶。這種濃縮效應可使蛋白質濃縮數百倍。
2. 電荷效應：樣品進入分離膠後，慢離子甘氨酸全部解離為負離子，泳動速率加快，很快超過蛋白質，高電壓梯度隨即消失。此時，蛋白質在均一的外加電場下泳動，但由於蛋白質分子所帶的有效電荷不同，使得各種蛋白質的泳動速率不同而形成一條條區帶。但在SDS-PAGE電泳中，由於SDS這種陰離子表面活性劑以一定比例和蛋白質結合成複合物，使蛋白質分子帶負電荷，這種負電荷遠遠超過了蛋白質分子原有的電荷差別，從而降低或消除了蛋白質天然電荷的差別；此外，由多亞基組成的蛋白質和SDS結合後都解離成亞單位，這是因為SDS破壞了蛋白質氫鍵、疏水鍵等非共價鍵。與SDS結合的蛋白質的構型也發生變化，在水溶液中 SDS-蛋白質複合物都具有相似的形狀，使得SDS-PAGE電泳的泳動率不再受蛋白質原有電荷與形狀的影響。因此，各種SDS-蛋白質複合物在電泳中不同的泳動率只反映了蛋白質分子量的不同。
3.分子篩效應：各種蛋白質分子由於分子大小和構象不同，因而在透過一定孔徑的分離膠時所受的摩擦力不同，表現出不同的泳動率，因而被分開。即使蛋白質所帶的淨電荷相似，也會由於分子篩效應被分開。
Acr與Bis的濃度和交聯度可以決定凝膠的透明度，黏度和彈性，機械強度和孔徑大小。通常用T表示兩種單體的總百分濃度，即100ml溶液中兩種單體的克數；C表示交聯劑(Bis)重量佔總單體重量的百分數，不同濃度單體對凝膠性質有影響。當Acr＜2%，Bis＜％，單體不能凝膠化；兩者均增加，則凝膠硬而脆而且不透明；兩者均減小，則凝膠軟而有彈性。由於兩個極端都不好，因此，在增加Acr的濃度的同時，應適當降低Bis的濃度。在5%~20%範圍內，T和C的數值可按下式選擇：C=。
聚丙烯醯胺凝膠很少帶有離子的側基，電滲作用小，對熱穩定，機械強度大，富有彈性，所以是區帶電泳的良好介質。利用SDS不連續聚丙烯醯胺凝膠電泳測分子量，結果準確，重複性好，其解析度至少在±0%。
本實驗採用SDS-PAGE對血清蛋白進行分離，考馬斯亮藍R-250染色，經脫色後，觀察其組成和相對含量（血清蛋白透過SDS-PAGE一般可分離出12~16條區帶）。
（三）實驗試劑
30%丙烯醯胺儲存液(Acr:Bis=29:1)，10%SDS，10%過硫酸銨，TEMED(四甲基乙二胺)，2%溴酚藍，固定液（%的三氯醋酸），染色液（稱取考馬斯亮藍R250，加入95%乙醇90ml,冰醋酸10ml，用時用蒸餾水稀釋4倍），脫色液（冰醋酸38ml,甲醇125ml,加蒸餾水至500ml），2×上樣緩衝液（20%甘油，1\/4體積濃縮膠緩衝液，2%溴酚藍），分離膠緩衝液( MTris-HCl緩衝液)（稱取加入1M HCl48ml,再加入蒸餾水稀釋至100ml），濃縮膠緩衝液( MTris-HCl緩衝液)，電極緩衝液（稱取甘氨酸及加蒸餾水至1000ml，調pH至）。
（四）實驗器材
垂直板電泳裝置，微量加樣器，可調式取液器，滴管
（五）實驗操作
1.配膠：A.安裝垂直板電泳裝置，用瓊脂糖封住底邊及兩側。B.製備SDS聚丙烯醯胺凝膠。
(1)%分離膠：30%丙烯醯胺儲存液，ddH₂，分離膠緩衝液()，10%，10%過硫酸銨。混勻後加入4μlTEMED,立即混勻，灌入安裝好的垂直板中，至距離槽沿3cm處，立即在膠面上加蓋一層雙蒸水，靜置，待凝膠聚合後（約20min），去除水相，然後用吸水紙吸乾殘餘的液體。
(2)配製5%濃縮膠：30%丙烯醯胺儲存液，ddH₂， ()，10%，10%過硫酸銨。混勻後加入2μlTEMED，立即混勻，灌入垂直板中至玻璃板頂部處，插入梳子，避免混入氣泡，靜置，待膠聚合後，加入電極緩衝液，拔去梳子。
2.樣品預處理：取20μl樣品加入20μl2x上樣緩衝液，置100°C沸水中煮2min。
3.上樣：每孔加入20μl樣品。
4.電泳：接通電源，將電壓調至80V。當溴酚蘭進入分離膠後，把電壓提高到150V,電泳至溴酚藍距離膠底部1cm處，停止電泳。
5.固定：取下凝膠，置於固定液中，輕輕振搖20min，倒去固定液。
6.染色與脫色：倒入50~60℃預溫的染色液浸沒凝膠，染色約30min。回收染色液，用清水沖洗掉凝膠上多餘的染色液。倒入脫色液，輕搖2h左右，其間換脫色液2~3次。
（六）注意事項
1.丙烯醯胺有神經毒性，可經面板、呼吸道等吸收，故操作時一定要注意防護。
2.蛋白加樣量要合適。加樣量太少，條帶不清晰；加樣量太多，則泳道超載，條帶過寬而重疊，甚至覆蓋至相鄰泳道。
3.對多種蛋白而言，電流大則電泳條帶清晰，但電流過大，玻璃板會因受熱而破裂。
4.過硫酸銨溶液最好為當天配置，冰箱裡儲存也不能超過一週。
（七）思考題
1.該實驗中是如何去除蛋白間電荷效應的？
2.使SDS-PAGE具有高解析度的三個因素是什麼？