實驗七 感受態細胞的製備(Preparation of Competent Cells)
一、實驗目的
基因克隆過程中，常常需要用人工的方法將外源DNA 轉移至特定細胞，這些細胞往往需要經過一定的處理，使之更容易接受外源DNA，經過處理的這種細胞，叫做感受態細胞(CompetentCells)。本實驗主要學習掌握感受態細胞的製備，為克隆做準備。
二、實驗原理
基因DNA如克隆過程中人工構建的質粒重組體等，只有轉入特定細胞如細菌後，才能得以擴增或表達。在自然條件下，細胞外圍所存在的小分子DNA可以透過物理擴散而進入細胞，但對大多數較大的DNA 分子(如人工構建的質粒重組體)來說，透過此種途徑進入細胞的量很小，甚至不可能。此時，我們可以用物理或化學的方法對細胞(如細菌)進行某種處理(如輕微破壞細胞膜或細胞壁)，使其很容易接受外源DNA。經過處理的這種細胞(細菌)便稱作感受態細胞。常用的方法，就是CaCl₂法。此處，便以此為例學習其製作過程。該方法的關鍵：在“冷”的環境下，對細胞以CaCl₂進行反覆處理。在“冷”環境下，對細菌進行低滲CaCl₂處理，造成細胞膨脹，同時Ca²⁺會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構，促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區域，使細胞膜通透性發生變化，極易與外源DNA相黏附並在細胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基一磷酸鈣複合物。
三、實驗材料
₂(50mM)，冰，甘油，EP管，移液器(1000μl)，細菌培養管及培養液(LB 培養液或培養基)，液氮。
2.細菌： 一般來說，感受態細胞的最基本要求是：沒有質粒、容易被鑽進去(一般是G⁻細菌，細胞壁薄)、營養條件一般(非苛養菌)。目前常用的細菌為DH5α或DH10B。此外，用於製作感受態細胞的細菌，一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(R⁻，M⁻)，它可以容忍外源DNA分子進入體內並穩定地遺傳給後代。受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法、CaCl₂、RbCl(KCl)等化學試劑法)的處理後，細胞膜的通透性發生了暫時性的改變，允許外源DNA分子進入。
四、實驗裝置
落地式低溫離心機，消毒櫃，-80℃冰箱，液氮罐。
五、實驗步驟
1.準備：①將 CaCl₂溶液置於冰上預冷；②準備好碎冰；③已經接種並生長的細菌培養皿（供應菌落）。
2.在已經生長細菌(DH5α或DH10B)的細菌培養皿上（見上準備部分），挑取一個菌落，接種至5ml細菌培養管（預先加入細菌培養液），37℃培養過夜（約16h)，並劇烈搖動(250-300rpm)。
3.第二天。取100μl，加入至200ml廣口培養瓶（預先加入100ml細菌培養液），37℃培養並劇烈搖動(250-300rpm)，至OD值之間。一般培養時間在3h左右。
4.將整個細菌培養瓶置於冰上30min，冷凍離心(3000g)5min。棄上清液，溶於冰凍的50ml M CaCl₂，輕輕搖晃，置於冰上20min。
5.冷凍離心(3000g)5min。棄上清液，溶於50ml M CaCI₂輕輕搖晃，置於冰上10min。
6.冷凍離心(3000g)5min。棄上清液，溶於20ml CaCl₂，並加入15%甘油，分裝(40μl\/管)。
7.快速置液氮冷凍，然後放置-80℃或液氮儲存。
六、注意事項
1.溫度是影響感受態細胞感受能力的主要因素，因而千萬注意低溫(-80℃)儲存。
2.製作過程中要避免其他細菌等微生物的汙染。
七、思考題
1.對製備感受態細胞的細菌，有何要求？
2.感受態細菌製備好之後，最需要注意的是什麼？
實驗八 細菌轉化、接種及陽性克隆的篩選(Transformation, Inoculation and Screening of Positive Colonies)
一、目的要求
1.熟練掌握熱休克法的原理及操作。
2.掌握運用PCR方法對陽性菌落進行篩選，以及對篩選過程中出現問題後的處理。
二、實驗原理
1.細菌轉化：重組體(recombinant)如質粒等只有轉入到相應的受體細胞(最常用的如細菌)，才能實現其不斷地乃至無限地擴增的目的。將重組體轉入細菌的過程叫做細菌的轉化。細菌的轉化首先要使細菌成為感受態細胞(competent cell，見實驗七感受態細胞的製備)，當細菌成為感受態細胞後，比較容易接受外源的DNA。細菌轉化有多種方式，例如熱休克法、電擊法以及化學法等等。這裡介紹比較常用的熱休克法。熱休克法簡單實用，而且易於操作。其原理就是在感受態細胞易於接受外源DNA的基礎上，使其處於短暫熱休克狀態，細胞膜通透性增加，從而使重組體DNA進入細菌。
2.細菌接種：轉化的細菌，需要恢復，然後接種於含有相應抗生素的細菌培養皿。由於線性的DNA分子不能複製(只有環狀DNA分子才能複製)。因而，理論上，經過酶切的目的基因以及載體，若沒有連線上並重新成為環狀的，在細菌培養皿上便不能生長。
3.細菌陽性克隆的篩選：如上接種部分所描述，在細菌培養皿上能夠生長的，說明細菌已經轉入了環狀DNA質粒分子。但環狀DNA分子中，一種是目的基因與質粒連線形成的，而另一類則很有可能是載體DNA自連形成的。所以，實際上能夠在細菌培養皿上生長的菌落，只有一部分是我們所要的正確的菌落(細菌含有已經插入目的基因的重組體)，所以還需要對菌落進行篩選。篩選的方法，有很多種，這裡以PCR方法為例說明之。所謂PCR方法，就是用PCR方法檢測某菌落是否含有目的基因的片段。
三、實驗試劑
感受態細胞，質粒重組體，能夠探測目的基因的PCR引物。
四、實驗器材
水浴槽或電熱模組，溫度計。
五、實驗操作
1.細菌轉化
(1)準備好碎冰、42℃水浴及計時器(timer)將EP管置於冰上、準備好37℃ LB細菌給
(2)將感受態細胞自-80℃冷藏櫃取出，置於冰上。至融化後，取40μl感受態細胞，置於已在冰上預冷的EP管。
(3)取重組體50-100ng，加入感受態細胞。置於冰上30min。
(4)看著計時器，快速將EP管移入42℃水浴，計時開始，90s時，快速將EP管移入冰上。
(5)加入LB細菌培養液200~300μl，37℃水浴，1h。
2.接種
(1)取含有相應抗生素的細菌培養皿（預先製作並存放於4℃），將轉化菌倒入培養皿，並以滅菌的玻棒鋪勻。
(2)倒置放於37℃搖床，1h。1h後翻轉，繼續置於37℃搖床過夜。
3.陽性菌落篩選
(1)第二天檢查菌落。準備10個細菌培養管，並各加入5ml LB培養液及相應抗生素，挑選10個菌落，每個加入一個細菌培養管。37℃搖床劇烈搖動約24h(過夜)。第二天用QIAgen質粒提取試劑盒（見實驗四質粒DNA的擴增及提取）提取質粒。
(2)用能夠探測目的基因的PCR引物對以上10個菌落提取的質粒進行PCR(見實驗三PCR獲取目的基因)
(3)凝膠電泳，若有目的基因條帶的就是陽性菌落。
六、實驗結果及分析
陽性菌落的篩選過程中，注意分析PCR結果。若PCR結果為陰性，考慮幾方面的原因：一者，可能是PCR本身的問題，如引物不合適或者PCR的溫度等引數不合適，所以可以調整引數或重新設計引物，再次PCR。二者，重組率較低或轉化率太低，遇到此種情況，可以選擇多個菌落進行PCR篩選。
七、注意事項
1.熱休克轉化，注意溫度及時間一定要準確，溫度過高或時間過長會導致細菌死亡。溫度過低或時間太短，重組體不易進入細菌。
2.陽性菌落的篩選，一般選擇10個菌落，但有時重組效率很低，可以選擇10個以上的陽性菌落進行PCR。
八、思考題
1.由於用於克隆的質粒一般帶有抗藥基因，因而克隆過程中，轉化後，接種於含有相應抗生素的培養皿，若能夠在培養皿上生長的菌落，都是重組體。此種說法正確與否？為什麼？
2.陽性菌落篩選過程，挑選10個菌落，經過PCR探測，並沒有發現陽性菌落。你認為可能的原因有哪些？下一步該怎麼辦？
附：免疫學實驗
實驗一 結核菌素試驗
一、實驗目的
掌握結核菌素試驗的原理、方法和結果制定。
二、實驗原理
結核菌素試驗是最常用的遲髮型超敏反應面板試驗，是體內測定機體細胞免疫功能狀態的方法之一。結核菌素是結核桿菌的菌體成分，注入機體後，如受試者曾經受過結核桿菌的感染，則結核菌素與致敏淋巴細胞特異性結合，釋放淋巴因子，在注射區域性形成遲髮型超敏反應性炎症出現紅腫、硬結。如受試者未受過結核桿菌的感染或未接種過BCG，則無超敏反應發生，故結核菌素試驗可用來測定機體是否有過結核桿菌的感染或BCG的接種效果，亦可用於檢測機體的細胞免疫功能狀態。此外，用動物檢查結核標本時，在接種前或後也常用此試驗來測定動物對結核桿菌的感染狀況。
三、實驗材料
豚鼠（約250g）、舊結核菌素、注射器、碘酒、酒精、針頭等。
四、實驗方法
1.取白色豚鼠（約250g），從皮下接種卡介苗1~2次，一個月後取同一豚鼠，剃去腹部一部分毛，用碘酒、酒精消毒後，於皮內注射 1:1000稀釋的結核菌素。
五、實驗結果
注射部位有紅腫、硬結，其直徑超過1cm時，即為陽性反應；無任何變化者，則為陰性反應。
六、注意事項
1.本試驗不宜用於結核活動期患者，特別是結核活動期的嬰幼兒。
2.常規試驗陰性者，可分別再用1：1000、1：100舊結核菌素作皮試，若仍為陰性者方可判斷為陰性反應。
七、思考題
為什麼結核菌素試驗可用於檢測機體的細胞免疫功能狀態？
實驗二 實驗動物過敏症
實驗動物過敏症屬於Ⅰ型超敏反應，與臨床常見的青黴素和異種動物血清引起的過敏性休克相似。透過實驗可進一步加深對I型超敏反應機理的理解，提高醫護人員對人類過敏性休克重要性的認識。
一、實驗目的
熟悉Ⅰ型超敏反應的發生機理和常見臨床表現。
二、實驗原理
先給動物注射異種蛋白，經過一定時間後，動物產生的IgE類抗體結合於肥大細胞和嗜鹼性粒細胞上，動物處於致敏狀態。當第二次給動物注射較大量相同抗原時，抗原與IgE結合，導致肥大細胞和嗜鹼性粒細胞脫顆粒，釋放活性介質，作用於效應器官，產生嚴重的過敏性休克。
三、實驗材料
1.動物：豚鼠(250g左右)。
2.抗原：人血清、雞蛋清。
3.無菌注射器、針頭、碘酒、酒精等。
四、實驗方法
1.取健康豚鼠2只，以甲、乙編號，分別從甲、乙2只豚鼠的腹腔或皮下注射1：10稀釋的人血清，使動物致敏。
2.致敏後14~21d，取甲豚鼠給以心臟注射未稀釋的人血清1~2ml，乙豚鼠給以心臟注射未稀釋的雞蛋清1~2ml。
3.注射後，1~5min觀察動物的狀態。
五、實驗結果
1.注射人血清者經幾分鐘之後，即出現煩躁不安，抓鼻、聳毛、咳嗽、打噴嚏等現象，繼而發生呼吸困難、大小便失禁，全身倒向一側，休克死亡。而注射雞蛋清者無任何症狀出現。
2.豚鼠解剖觀察肺臟的變化，可見甲豚鼠肺臟極度氣腫，而乙豚鼠肺臟正常。
六、注意事項
1.致敏途徑除皮下外，還可以採用腹腔免疫，一般在注射後2~3周，動物即可達到高致敏狀態，並可維持幾個月。在此期間用相同抗原進行再次注射時，可引起休克反應。
2.作抗原再次注射時，應採用靜脈或心內注射的途徑，使抗原直接進入迴圈，才能引起明顯的休克反應，如採用腹腔或皮下注射，只能產生延緩性休克，甚至不發生休克反應。
七、思考題
結合動物實驗，解釋Ⅰ型超敏反應發生的機理，並說明為什麼乙豚鼠無超敏反應發生？