一、目的要求
(一)掌握減數分裂過程及各主要時期的形態特點。進一步理解染色體減半的機理和意義。
(二)瞭解蝗蟲、小鼠、蛙等動物生殖細胞減數分裂標本的製備方法。
二、實驗用品
(一)材料：蝗蟲精巢固定標本或切片標本，成熟雄性小鼠，活雄蛙，蛙精子形成過程中減數分裂玻片標本。
(二)器材：顯微鏡、離心機、冰箱、恆溫水浴箱、解剖器械、酒精燈、普通天平、載玻片、蓋玻片、吸管、離心管、擦鏡紙、吸水紙。
(三)試劑：乙酸地衣紅，濃度為\/L的KCl溶液，甲醇、乙醇、冰乙酸，磷酸緩衝液，100μg\/mL秋水仙素，Giemsa染液。
三、內容與方法
(一)蝗蟲精巢生殖細胞減數分裂標本製備及觀察
雄性蝗蟲二倍體細胞染色體為23條，性染色體為XO型。雌性蝗蟲二倍體細胞染色體24條，性染色體為XX型。
1.取材
夏秋季節，採整合熟的雄性蝗蟲，剪去背部翅膀和後肢，剪開腹部背中線，取出腹腔中的兩個精巢（每個精巢由許多精小管集合而成，精小管一端遊離，另一端通人輸精管）。將精巢放入卡諾氏固定液（甲醇3份，冰乙酸1份）固定24小時，然後放入95%、80%乙醇中各30分鐘，儲存於70%乙醇(4℃冰箱)中備用。
2.蝗蟲精巢小管的壓片
用小鑷子取1~2根精小管，置載玻片中央，滴加一滴乙酸地衣紅，染色30分鐘，再滴加一滴乙酸地衣紅，將精小管分成若干段，蓋上蓋玻片，上面覆蓋1~2層吸水紙，用手指輕輕一壓，吸掉多餘染液，再用右手拇指用力一壓：使細胞和染色體鋪展開，然後鏡檢。
3.蝗蟲精巢切片標本觀察
將切片標本置於低倍鏡下觀察，可見標本中有呈長橢圓形的縱切面和呈圓形的橫切面，排列著不同發育階段的生殖細胞。在低倍鏡下選擇減數分裂區，再轉換高倍鏡，觀察各期的形態學特徵。
(1)精原細胞(spermatogonium):精原細胞呈圓形或橢圓形，核大且染色較深，核內染色質呈團塊狀，不規則排列。細胞質和細胞膜染色較淺。
(2)初級精母細胞(primary spermatocyte):由精原細胞經過生長期發育而成。每個初級精母細胞經過第一次成熟分裂，形成兩個次級精母細胞。
第一次成熟分裂，根據細胞形態變化分為前期Ⅰ、中期Ⅰ、後期Ⅰ、末期Ⅰ四個時期。
前期Ⅰ(prophase Ⅰ):持續時間最長，染色體變化比較複雜。根據染色體特徵和行為分為五個分期：
細線期(leptotene):構成染色質的DNA分子螺旋化程度不高，呈特別細長的線狀，稱染色線，其上可見很多染色深的顆粒，稱染色粒(chromomere)。染色線互相纏繞成線團樣形態，有的核中可見核仁。
偶線期(zygotene)：同源染色體在此期配對，又稱聯會(synapsis)。可見染色體一端常聚在核的一側，另一端散開，呈花束狀。配對是沿著染色體縱軸從某些部分開始，後漸擴充套件至整條染色體並排在一起，一般仍見不到雙重結構。聯會的結果是每對染色體形成一個二價體（四分體）。
粗線期(pachytene):同源染色體完成配對，因此時DNA雙鏈已漸螺旋化，染色體不斷變粗短，使二價體中的四條染色單體相互扭絞在一起，呈粗線條狀，因此整個核中染色體分佈較為稀疏。
雙線期(diplotene):此期染色體顯得更粗短，二價體中的同源染色體互相排斥並趨於分離，在某些點上相互連線，形成各種交叉影象（由於同源非姐妹染色單體之間互換所致)，二價體中形成“0”、“8”、“X”、“V”、“+”等不同形態。
終變期(diakinesis)：二價體變得最粗短，核膜、核仁消失，但染色體仍在一個核的範圍。
中期Ⅰ(metaphase I):二價體移向細胞中部，排列在赤道面上形成赤道板，同源梁色體的著絲粒分別與紡錘絲相連。
後期Ⅰ(anaphase I):同源染色體受兩極紡錘絲的牽引彼此分離，分別移向細胞兩極(各為2個二分體)，一極得到11條染色體，另一極為11+X。
末期I(telophase I):染色體到達兩極後開始解螺旋成染色質，核膜、核仁出現。細胞膜中部縊縮，胞質分裂，形成2個次級精母細胞。這時的染色體數目減少了一半。
(3)次級精母細胞(secondary spermatocyte):較初級精母細胞小，經過第二次成熟分裂後形成2個精細胞。這一過程也分為間期、前期Ⅱ，中期Ⅱ、後期Ⅱ、末期Ⅱ，但因持續時間很短，在標本中通常只能看到中期Ⅱ。
前期Ⅱ(prophaseⅡ)：很短暫，染色體形態與末期I相似，不易區別。
中期Ⅱ(metaphaseⅡ)：此時的染色體，由一個著絲粒連線兩條姐妹染色單體，又稱二分體。二分體排列在細胞中部赤道面上。側面觀，染色體排列呈一直線；極面觀則排列成一圈，像花瓣狀。
後期Ⅱ(anaphaseⅡ)：二分體由於著絲粒縱裂為二而使姐妹染色單體分離，分別移向兩極、形成兩組子染色體。
末期Ⅱ(telophaseⅡ)：各組子染色體到達兩極後解螺旋成染色質，核膜、核仁出現，胞質分裂形成兩個精細胞。
(4)精細胞(spermatid):細胞形態同間期細胞，體積小，核較大，胞質較少。
(5)精子(sperm):精細胞經過變形期，形成精子。精子分為頭部，中段和尾絲三部分。頭部由圓形變化為橢圓形、長梭形，最後呈針形。中段位於頭部之下，極短。尾絲細長，是由鞭毛形成的運動細胞器。
(二)小鼠睪丸生殖細胞減數分裂標本製備及觀察
1.標本製備
(1)取材：選擇18-22g健康雄性小鼠，腹腔注射秋水仙素(2μg\/g體重)作用4~6小時，頸椎脫臼法處死小鼠，取出睪丸（注意睪丸可位於腹腔或陰囊內)，用生理鹽水洗淨，剝去睪丸被膜，除去附睪、脂肪及結締組織。
(2)低滲：將宰丸放人小培養皿中，加入少量 KCl低濾液，然後用小鑷子將成團的精細管分離開，加入預溫(37℃)的低滲液7mL、移人離心管中，於37℃恆溫水浴箱內低滲30分鐘。
(3)固定：取出離心管，勿搖動。用吸管吸棄低滲液，加人卡諾氏固定液6一8mL,固定20分鐘。
(4)軟化：勿搖動。吸棄周定液，加入60醋酸溶液約2mL,輕搖，見精細管溶化，立即加入固定液至5一8mL,用吸管混勻，離心(1000r\/min)8分鐘。
(5)再固定：吸棄上清液，加入5-8mL固定液，再固定一次。離心、吸棄上清液。視細胞多少加入適量新鮮固定液(~)，製成細胞懸液。
(6)滴片：取潔淨冰溼的載玻片，滴2~3細胞懸液於載玻片上（滴片時，吸管與載玻片之間應有一定高度，為20一30cm,以利於染色體分散)，遠火乾燥或自然晾乾。
(7)染色：用10%Giemsa染液染色10一15分鐘、自來水沖洗，空氣乾燥。
2.標本觀察
鏡下可見許多染色較深和處於有絲分裂過程的精原細胞，處於波數分裂各分期的細胞。(參考蝗蟲減數分裂時期形態的描述，仔細尋找並觀察前期Ⅰ的細線期、偶線期、粗線期、雙線期、終變斯及中期Ⅰ細胞的二價體形態，中期Ⅱ的二分體細胞、精細抱、精子)。
小鼠染色體相對較大，X染色體和Y染色體一端靠攏，端部聯會。終變期呈一特殊的“!”形態，中期Ⅰ時X染色體和Y染色體先行分離，精子呈鐮刀狀。
(三)蛙生殖細胞減數分裂標本製備及觀察
1.標本製備
(1)取材：將動物室供給的或由集市上買來的青、壯雄蛙，置於動物飼養缸培養24小時。
(2)注射秋水仙素：將培養的活雄蛙按體重100g注入腹腔%的秋水仙素。將已注射的活蛙置於盛有水~深的容器中，使其在30℃~35℃溫箱中培養24小時後，取出精巢（睪丸）去被膜，在 KCl低滲溶液中輕輕搗碎，（小培養皿中加入低滲液約3~5mL),使細胞充分溢位，用吸管將含有細胞的低滲液移至離心管內，再加低滲液7~8mL,室溫處理1小時，或置37℃恆溫水浴箱中處理45分鐘。
(3)離心：在1000r\/min下離心5~7分鐘後去其上清液。
(4)固定：加（甲醇3份，冰乙酸1份）固定液7~8mL,固定25~30分鐘（並用吸管輕輕地充分將細胞衝散)。
(5)離心：與第三步一樣，如此重複固定2次即可。
(6)將上清液去掉，留下含有細胞的固定液1~2mL。
(7)滴片：用冰凍的清潔玻片，滴細胞懸浮液1~2滴，使細胞充分分散。
(8)空氣乾片法：將已滴的玻片置於室溫中乾燥。
(9)染色：將已全部乾燥的玻片置於Giemsa染液中染色20一25分鐘(Giemsa染液應調至)。
(10)沖洗：用蒸餾水徐徐沖洗染料，待玻片乾燥後，再用顯微鏡觀察。
2.標本觀察
低倍鏡下可見到許多染成紫藍色梭形的東西，即是精子的頭部，細絲的尾部因製片過程被去掉了。另外還有深藍色的小圓球是未分裂的精原細胞和較小的精細胞，仔細尋找減數分裂過程中幾個主要時期。
(1)精原細胞分裂中期：這一時期染色體形狀和數目，和一般有絲分裂一樣，有大小長短不同的染色體13對(26條)（即2N=26)。
(2)第一次減數分裂前期：這一時期，根據染色體的形狀特點依次又分五個階段：細線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期（又叫濃縮期）。
細線期：從分子水平來看，染色體中的主要物質DNA雙鏈螺旋化不太高，整個染色體已有一定的濃縮程度，這是減數分裂第一階段，染色體成細絲狀，盤繞在核的範圍內，有的可看見核仁和核膜。
偶線期：這一期為同源染色體配對或聯會的階段，染色體配對從某些部分開始。以後整條染色體相互並排一起。這一時期染色體仍細長，相互盤繞在核的範圍內，在某起部分可看到染色體互相併排，此期，很難和細線期區別，可從略不看。
粗線期：DNA雙鏈已有較高的螺旋化，而且四條DNA雙鏈分子即4條染色單體互相扭絞一起，所以這一階段染色體明顯變短變粗，在某些區域仍可看到染色體成對的現象。
雙線期：這一時期染色體顯得更短更粗，同源染色體已開始分離，這一時期每對染色體含有4條染色單體，但分開不完全，因此在某些點上可有交叉現象，由於製片的原因，這些特點在有些玻片上沒有顯示出來。
終變期：這一時期，由於染色體高度濃縮顯得更加粗短，即DNA雙鏈分子高度爆旋化而且在某些點上仍有交叉聯絡，這一時期多數染色體成環狀，有的標本可清楚數出3條環體（即13對染色體)是為終變期。
(3)第一次減數分裂中期（中期Ⅰ）：終變期完結後就進入這一時期，每一對同源染色體有四條染色單體（因染色體濃縮不易分辨單體，但四條染色單體只有兩個著絲粒，13對染色體都排在細胞中央，此期核仁、核膜都已消失。
(4)第二次減數分裂中期（中期Ⅱ）：第一次減數分裂完成後經過很短時間就進入第二次減數分裂。它也分前、中、後、末四個時期，不過我們在玻片標本上只看到中期，到這一時期末染色體已由原來26條減去了一半（即同源染色體減去一半，N=13),可清楚數出13條染色體，每條染色體由兩條姐妹染色單體以一個著絲粒相連。
四、作業與思考題
(一)作業
繪製觀察材料生殖細胞減數分裂各時期圖。
(二)思考題
1.與有絲分裂相比減數分裂有哪些重要變化？
2.減數分裂有何意義？為什麼說它是遺傳三大規律的細胞學基礎？
3.染色體數目減半發生在兩次連續分裂的哪一次？
附錄 試劑配製
(一)乙酸地衣紅的配製：地衣紅(orciene)2g,冰乙酸45mL,充分溶解，再加入55mL蒸餾水，配好後，使用之前過濾。
(二)Giemsa染液的配製：Giemsa粉1g,甘油(AR)66mL,甲醇(AR)66mL,先將Giemsa粉溶於少量甘油中，用研缽研磨成勻漿，將全部甘油倒入。放入56℃恆溫水浴箱中2小時，取出，將甲醇加入，混勻，即成原液，於棕色瓶中密封儲存備用。用時以磷酸緩衝液稀釋即成。
(三)磷酸鹽緩衝液的配製：
甲液濃度為1\/15mol\/L的KH₂PO₄,加蒸餾水至1000mL。乙液濃度為1\/15mol\/L的Na₂HPO₄,加蒸餾水至1000mL。
取甲液,乙液,混勻後調pH至，放冰箱內儲存備用。