血清學技術的第一步是獲得高純度、強特異性的抗原或抗體。
適量抗原經合適的途徑注射動物，能激發動物產生免疫應答，使其B 細胞分化成漿細胞，產生特異性抗體並釋放入血。當血中抗體達到一定效價時採血，即可獲得特異性免疫血清(通常稱之為抗血清)。由於抗原分子具有多種抗原決定簇，可分別啟用具有不同抗原識別受體的B細胞產生相應的抗體， 即多克隆抗體(polyclonal antibody)。目前人工製備的特異性抗體有多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體等。抗體是免疫學實驗中常用的材料，已知的診斷血清(抗體)常用於對抗原的分析鑑定和定量檢測。
針對某種抗原製備特異性抗血清是免疫學的基本技術之一。根據抗原的生物學和理化特性，可用不同的方法制得高純度的免疫原；再進行不同形式的處理(例如加入佐劑)，可使其具有更強的免疫原性。
本試驗以傷寒沙門菌H抗原和O抗原、綿羊紅細胞(SRBC)和人全血清為免疫原，以家兔為免疫動物，製備兔抗傷寒沙門菌、兔抗SRBC和兔抗人血清的免疫血清。要求學生初步學會免疫原和佐劑的製作及免疫血清製備的基本方法，瞭解其意義和應用，熟悉動物實驗的基本知識。
一、傷寒沙門菌抗血清的製備
（一）實驗目的
掌握免疫血清製備的原理及其方法。
（二）實驗原理
傷寒沙門菌H抗原為鞭毛抗原，屬鞭毛蛋白質，不穩定，可經甲醛固定；O抗原為菌體抗原，屬細胞壁脂多糖，性質穩定、耐熱。將製備好的H、O抗原分別免疫健康家兔，家兔體內可產生高效價的抗H抗體和抗O抗體，並主要存在於兔血清中。
（三）實驗材料
1.菌株：傷寒沙門菌標準菌株(H901)、傷寒沙門菌標準菌株(O901)。
2.培養基：普通瓊脂培養基、普通瓊脂平板、普通瓊脂斜面培養基、肉湯培養基。
3.生理鹽水、%甲醛生理鹽水、37℃水浴箱、恆溫培養箱。
4.無菌三角瓶、試管、刻度吸管、水平離心機、接種環、酒精燈。
氏標準比濁管。
6.健康家兔(體重為2~)。
7.無菌注射器(2ml)、5號針頭、2%碘酒、75%酒精、無菌棉籤等。
（四）實驗方法
1.製備傷寒沙門菌H抗原
(1)接種經鑑定的傷寒沙門菌H901菌株至普通瓊脂平板內，37℃培養16~24h，挑選典型光滑型菌落轉種至普通瓊脂斜面，37C培養18一24h。
(2)加5ml無菌肉湯至接種有細菌的普通瓊脂斜面上，靜置5~10min，搓動試管，製成細菌懸液。
(3)將細菌懸液接種於15cm瓊脂平板內，儘量鋪平於培養基表面（可用塗布棒塗布），37℃培養16~24h。
(4)用適量無菌%甲醛生理鹽水沖洗刮取菌苔，移入無菌三角瓶內，置37℃水浴24h，固定殺菌。
(5)取少許經甲醛生理鹽水處理的菌液接種於肉湯培養基作無菌試驗。無菌生長者用無菌生理鹽水稀釋至5億~10億菌\/ml(用Brown氏標準比濁管測定)，即獲得傷寒沙門菌H抗原，4℃儲存備用。
2.製備傷寒沙門菌O抗原：採用經鑑定的傷寒沙門菌O901菌株，方法同上。收穫細菌時，取出大平皿，用適量生理鹽水沖洗刮下菌苔，移入無菌三角瓶，100℃水浴2h殺菌（或用%石炭酸鹽水沖洗刮下菌苔，置37℃水浴過夜殺菌)。作無菌試驗合格後，用生理鹽水稀釋成5億~10億\/ml，加入石炭酸至終濃度為5%即成O抗原菌液。4℃儲存備用。
3.動物的選擇：選擇合適的動物進行免疫極為重要，除了要求動物健康外，還應考慮以下兩個因素：①抗原與免疫動物的種屬差異越遠越好：親緣關係太近不易產生免疫應答（如兔一大鼠之間，雞一鴨之間)；②抗血清量的需要量：大動物如馬、驟等可獲得大量血清（一頭成年馬反覆採血可獲得10000ml以上的抗血清)，但有時需要抗體的量不是很多，選用家免或豚鼠即可。本實驗選用家兔較合適。選好動物後，檢測其體內是否含有天然抗體（取兔耳緣靜脈血，分離血清分別與傷寒沙門菌H和O抗原做試管凝集反應)，只選擇不含傷寒沙門菌H和O抗原天然抗體家兔進行免疫。最後，將家兔隨機分為2組，做好標記。
4.免疫方法：免疫前，用生理鹽水將傷寒沙門菌H和O抗原洗滌3遍，然後稀釋至9億\/ml。兔耳緣經碘酒和酒精消毒後，從耳緣靜脈注射抗原（分H抗原和O抗原兩組）。
免疫日程(d)：1；注射劑量(ml)：。
免疫日程(d)：2；注射劑量(ml)：。
免疫日程(d)：3；注射劑量(ml)：。
免疫日程(d)：4；注射劑量(ml)：。
免疫日程(d)：5；注射劑量(ml)：。
免疫日程(d)：6；注射劑量(ml)：。
5.檢測血清效價：末次注射後7~10d，抽兔耳靜脈血1ml,分離血清與相應的抗原作試管凝集反應，若血清效價大於1：1280，即可收穫血清。若效價偏低，再用相應抗原3ml加強免疫１-2次，可使抗體效價明顯升高。
6.收集血清：試血合格後，經頸動脈或心臟採血，置於乾燥無菌的三角瓶內， 37℃30min，再置4℃冰箱，使血清析出，吸出血清成分以2000rpm離心20min，棄紅細胞；檢測凝集效價後，適量分裝, -20℃凍存備用，也可加入%的疊氮鈉(NaN₃) 防腐。
附： 常用採血方法介紹
1.頸動脈放血法： 是最常用的方法，對家兔、山羊等動物皆可採用。在動物頸外側做面板切口，拉開面板後可見斜行的胸鎖乳突肌，將此肌鈍性分離並推向後方，即可見到淡紅色有彈性的總動脈。將此動脈輕輕遊離(連同與之同行的迷走神經)，用絲線將遠心端結紮，近心端用止血鉗夾住，另一止血鉗夾住動脈迷走神經，用以固定。沿結紮處剪斷血管，用固定止血鉗將斷端放入瓶口，慢慢開啟夾持的止血鉗，動脈血立即噴射入瓶。如此放血的速度快，動物死亡也快， 取血量略少於其他放血法。如在放血大約總量的一半時，暫時將動脈夾住片刻，再繼續放血，得血量可以多些。
2.心臟採血法：多用於豚鼠、大鼠、雞等小動物。採血技術應熟練，穿刺不準容易導致動物急性死亡。
3.靜脈多次採血法：家兔可用耳中央靜脈，山羊可用頸靜脈。這種放血法可隔日一次，有時可採集多量血液。如用耳靜脈切開法，一隻家兔可採百餘毫升血液(用頸動脈放血最多可獲70~80ml，一般只有50ml左右)。用頸靜脈採集綿羊血，一次可放 300ml，放血後立即回輸10%葡萄糖鹽水， 三天後仍可採血200~300ml。動物休息一週，再加強免疫一次， 又可採血二次。如此，一隻羊可獲1500~2000ml血液。小鼠取血往往採取斷尾或摘除眼球法，每鼠得血一般不超過2ml。
抗血清的分離多采用室溫自然凝固，然後放置37℃或4℃下待凝塊收縮。前者迅速，但得血清較少；後者時間長，有時還會出現溶血，但獲得血清多，而且效價不易下跌。
二、綿羊紅細胞溶血素的製備方法
（一）實驗目的
掌握綿羊紅細胞溶血素製備的原理及其方法。
（二）實驗原理
綿羊紅細胞(SRBC)對家兔、小鼠等動物屬於異種抗原。用SRBC懸液免疫家兔，家兔可針對SRBC的刺激產生體液免疫應答，合成和分泌大量抗SRBC抗體，主要存在於被免疫兔的血清中。
在試管內抗SRBC抗體與SRBC可發生結合，加入補體後，在一定條件下，經一定時間會導致SRBC的溶解, 故抗SRBC抗體又稱為溶血素。
（三）實驗材料
健康綿羊，採血器材（無菌注射器(50或100ml)、16號針頭、剪刀、止血帶、酒精燈、無菌棉球、%碘酒、75%酒精等），無菌三角瓶（內裝阿氏紅細胞儲存液），無菌離心管和吸管，橡皮乳頭，血球計數器，無菌生理鹽水、水平離心機，健康家兔。
（四）實驗方法
1.製備綿羊紅細胞懸液
(1)用帶子交叉捆住綿羊四肢，使其側臥於地。剪去頸部部分毛，用止血帶扎住頸部，確定頸靜脈。
(2)用%碘酒和75%酒精消毒綿羊面板及採血者手指，持注射器，與頸靜脈呈30°角，從頭部向軀幹方向進針，緩慢抽動針芯，觀察是否進入靜脈。一旦抽出血液，即固定注射器，抽取50~80ml血液，迅速注入含阿氏紅細胞儲存液的三角瓶內，立即混勻，4℃冰箱儲存備用。
(3)取適量脫纖維羊血於離心管內，離心2000rpm5min，吸棄上清液及紅細胞沉積物表面的白膜，加適量無菌生理鹽水，毛細吸管吹吸幾次以混勻，再離心棄上清液，重複3次。
(4)最後一次離心2000rpm10min，根據紅細胞壓積，用生理鹽水配成10%SRBC懸液。
(5)取少許10%紅細胞懸液再稀釋200倍，血球計數板計數後，配成×10個細胞\/ml。
2.免疫方法
免疫日程(d)：1；注射劑量(ml)：；注射途徑：皮下。
免疫日程(d)：3；注射劑量(ml)：；注射途徑：皮下。
免疫日程(d)：5；注射劑量(ml)：；注射途徑：皮下。
免疫日程(d)：7；注射劑量(ml)：；注射途徑：皮下。
免疫日程(d)：9；注射劑量(ml)：；注射途徑：皮下。
免疫日程(d)：12；注射劑量(ml)：；注射途徑：皮下。
免疫日程(d)：15；注射劑量(ml)：；注射途徑：皮下。
免疫日程(d)：20；注射途徑：試血。
3.收穫溶血素：免疫注射第20天試血，溶血效價達1：2000以上時，收穫血清，用％疊氮鈉防腐，4℃儲存備用。
三、兔抗人血清的製備
（一）實驗目的
掌握兔抗人血清製備的原理及其方法。
（二）實驗原理
以混合人血清免疫家兔為材料，可獲得兔抗人血清抗體。為使混合人血清能誘導家兔產生高效價特異性抗體，需新增佐劑。本試驗採用弗氏完全佐劑，它可使抗原在體內緩慢釋放，延長抗原在體內的停留時間，以獲得較佳的免疫效果。
（三）實驗材料
健康家兔（體重2~)，混合人血清，弗氏完全佐劑，無菌乳缽、滴管、注射器、9號針頭、%碘酒、75%酒精、無菌棉籤等。
（四）實驗方法
1.混合人血清抗原的製備：選健康志願者（學生）或獻血員，靜脈採血5ml放試管中置室溫下使其自然凝集，凝集後離心取上清約。將多人（至少2~3人，最好10人以上）的血清混合，即為可用的人全血清。將人全血清用生理鹽水作1：2~1：5稀釋。
2.佐劑的製備：為了促進抗體產生，可在注射抗原的同時，加入一種輔助劑，這種輔助劑稱為佐劑。佐劑一般是乳劑或懸液，當與水溶液抗原混合後形成一種油包水或水包油的乳狀顆粒，這種顆粒延緩了抗原的釋放，增加了區域性刺激作用。抗原與佐劑同時應用，可促進抗原在淋巴組織中存留。佐劑本身可以有免疫原性，也可不具備免疫原性。常用的有免疫原性的佐劑有百日咳桿菌、革蘭氏陰性桿菌的內毒素和抗酸桿菌（如結核分枝桿菌）等；非抗原性的佐劑有鋁乳、磷酸鈣、石蠟油、羊毛脂、表面活性劑、藻酸鈣、聚核苷酸、胞壁肽等。應用最多的是福氏(Freund)佐劑，是用石蠟油、羊毛脂和卡介苗混合而成的。
福氏佐劑分為不完全佐劑和完全佐劑，稱取羊毛脂12g,加液體石蠟20m。高壓蒸汽滅菌後即成為福氏不完全佐劑。在福氏不完全佐劑內加入一定量的死卡介苗，成為福氏完全佐劑。佐劑和抗原的比例為1：1。
3.在福氏完全佐劑中逐滴加入等體積的混合人血清，置於無菌乳缽中，朝一個方向研磨，每加1滴，都要研磨均勻後再加第2滴，直到乳缽內形成油包水的白色乳劑。將乳劑滴加於水中完全不散開時為合格。另一種方法是用兩個5ml注射器，在接針頭處用一尼龍管連通，一個注射內是佐劑，另一注射器內為抗原。裝好後來回推注，經多次混合逐漸變為乳劑。本法優點是無汙染，節省抗原或佐劑，用此注射器可直接注射；缺點是不易乳化完全。乳化完全與否的鑑定方法是將一滴乳劑滴入水中，如立即散開，則未乳化好，如不散開漂在水面則為乳化完全。為了防止汙染，有時在佐劑中加入抗生素。但抗生素有免疫抑制作用，如能注意無菌操作，就不必加入。
4.將乳劑抗原吸入不帶針頭的注射器內，接上針頭後，儘量排除空氣，用無菌大試管套住注射器，於4℃儲存。
5.按免疫程式進行免疫注射。
免疫日程(d)：1；注射劑量(ml)：；注射途徑：後肢足蹼。
免疫日程(d)：7；注射劑量(ml)：；注射途徑：淋巴結。
免疫日程(d)：14；注射劑量(ml)：；注射途徑：背中皮內6點。
免疫日程(d)：21；注射劑量(ml)：；注射途徑：背部皮下6點。
免疫日程(d)：28；注射途徑：試血。
6.末次注射後7~10d試血。用免疫兔耳緣靜脈血血清為抗體，用生理鹽水作不同倍數稀釋；用12倍稀釋的混合人血清為抗原。按照沉澱反應要求，作瓊脂雙向擴散試驗，以測定抗體效價。效價達1：32以上，即可心臟採血，分離並收穫抗血清。
7.做好標記，適量分裝，-20℃凍存。
（五）注意事項
1.選擇動物時，動物種系與抗原來源的差異越遠越好。動物應健康，處於青壯年時期。無特殊要求時最好為雄性。因有個體差異，故每種抗原最好免疫2~3只動物。
2.本實驗每個步驟都必須嚴格執行無菌操作，防止抗原的汙染。
3.菌液濃度可用比濁法調正。
4.從耳緣靜脈抽血前，最好先用二甲苯塗擦耳緣背部，使其充血便於進針。助手必須捏住兔耳根直至抽血完畢。
5.製備壓積紅細胞時，應無菌操作，避免劇烈振盪；試管應洗滌潔淨，充分乾燥，以免發生溶血。
6.全血清做抗原時要用混合血清，以避免個體差異帶來的誤差。
7.紅細胞和細菌等顆粒性抗原比較容易誘導免疫應答，可直接用來免疫動物；而血清等可溶性抗原則需要加入免疫佐劑，充分乳化，否則不易免疫成功。
8.免疫時採用皮內多點注射易透導免疫應答，提高血清的抗體效價。
9.免疫間隔時間無固定模式，但一般可溶性抗原首次免疫和第二次免疫以間隔10~20d為宜。
（六）思考題
1.免疫血清製備的原理是什麼？
2.試述免疫血清的應用。
3.為什麼製備H抗原的傷寒菌液要用%甲醛生理鹽水處理？
4.在製備SRBC懸液的過程中，為何離心後要吸棄紅細胞沉積物表面的白膜？
5.為什麼要採用多份人血清混合來製備人血清抗原？
6.佐劑的種類有哪些？主要成分是什麼？如何製備？有何用途？
7.為什麼不同抗原免疫動物的途徑和程式不同？
8.檢測抗血清效價的方法有哪些？