實驗二 T、B淋巴細胞亞群的檢測
一、E花環試驗
（一）實驗目的
1.掌握E花環實驗的定義、E花環實驗的原理。
2.熟悉E花環實驗結果的計算公式。
（二）實驗原理
人T細胞表面表達綿羊紅細胞(SRBC)受體(E受體，CD2)，在體外一定條件下，能與SRBC結合形成花環，即E花環。T細胞中有部分細胞與SRBC親和力強，在室溫中只需數分鐘即可形成花環，這種紅細胞花環又稱為活性E花環(Ea)。另一部分T細胞則與 SRBC親和力較弱，需在4℃放置1h以上才形成花環，這種紅細胞花環又稱為總E花環(Et)。Et代表T細胞總數，Ea代表細胞免疫中最先出現效應功能的T淋巴細胞亞群，能敏感地反應機體的細胞免疫功能狀態。
（三）實驗材料
1.新鮮綿羊抗凝血、靜脈血(肝素抗凝)、、8%戊二醛、1%甲紫。
2.離心管、毛細滴管、離心機、血球計數板、水浴箱、冰箱、顯微鏡。
（四）實驗方法
1.外周血單個核細胞的分離
（1）靜脈取血2ml，加入含肝素溶液(10~50μ\/ml血樣本)的試管中，混勻，使血液抗凝。用 液將抗凝血稀釋1倍。
（2）吸取2ml淋巴細胞分層液置於刻度離心管中，然後將離心管傾斜45°角，用毛細滴管將稀釋的全血沿管壁緩慢加至分離液上面，應注意保持兩者介面清晰。
（3）在18~20℃下，用水平離心機以2000r\/min離心20min。
（4）用毛細吸管輕輕插到混濁帶，沿管壁輕輕吸出此層細胞，移入另一支離心管中。既要吸取所有單個核細胞，又要避免吸取過多的分層液或血漿， 以免混入其他細胞成分。
（5）用Hanks液洗滌細胞3次。第一次2000r\/min，10min；第2~3次1000r\/min，10min，可去掉大部分混雜的血小板。
（6）用 Hanks液重懸細胞，混勻，計數，調整細胞濃度為3×10⁶細胞\/ml。
2. Ea花環的形成
（1）取 100μlPBMC 懸液於一乾淨小試管中,再加入 100μl SRBC(濃度為 6×10⁷細胞\/ml)(L:SRBC=1:20), 輕輕混勻。37℃水浴5min。
（2）1000r\/min離心5min，然後輕輕旋轉試管搖起細胞。
（3）加%戊二醛4.加2滴1%甲紫液染色1~2min。
（5）取1~2滴懸液滴於載玻片上，蓋上蓋玻片，在高倍鏡下觀察花環形成情況，並計數200個淋巴細胞中形成花環的淋巴細胞數。
（五）實驗結果
顯微鏡下可見淋巴細胞著藍色，SRBC為紅色（不染色）。凡吸附3個以上SRBC的淋巴細胞，即為Ea花環形成細胞。根據以下公式計算Ea花環形成細胞的百分率。
計數200個淋巴細胞，凡結合3個SRBC或以上者為E花環陽性細胞，按下式計算E花環形成率。
E花環形成率(%)=形成花環的細胞數\/（形成花環的細胞數+未形成花環的細胞數）×100%
正常參考值(X±SD)：EtRFC ±%
（六）注意事項
1.若為Et花環形成試驗，則SRBC與淋巴細胞之比不低於80：1，以100：1為宜。SRBC與淋巴細胞混勻後置37℃水浴10min，然後1000r\/min離心5min，再置4℃冰箱2h。正常值為±%。
2.小牛血清可增加E花環形成率，因此可在分離出PBMC後配製PBMC懸液時加入20%小牛血清。
與T淋巴細胞間連線不穩定，易受機械振搖而解離，故應用最溫和的方法使已形成的花環沉澱細胞懸浮。
需新鮮，在Alserver液中儲存不得超過2周，以1周內較好。
5.只有活的T淋巴細胞才能與SRBC形成E花環，因此標本採取後要及時測定，放置時間不得超過3~4h。
6.室溫太高可使E花環形成率下降，以4~24℃為宜。
二、細胞膜表面免疫球蛋白(Smlg)測定
（一）實驗目的
掌握B淋巴細胞膜表面標誌物檢測的原理和方法。
（二）實驗原理
膜表面免疫球蛋白(surface membrane Ig，Smlg)是人類B淋巴細胞表面的特異標誌之一，能與相應的特異性抗體結合，故可用熒光素標記的抗人全Ig血清作免疫熒光鏡檢。由於B細胞在分化過程中的每個階段均具有SmIg的標誌，故該方法可檢出全部B淋巴細胞。每一個B淋巴細胞面可攜帶不同類Ig，IgM、IgD、IgG、或IgE，如分別用單價熒光抗Ig血清染色，則可鑑別帶不同Ig類的B淋巴細胞。凡與熒游標記抗體結合的細胞，在熒光顯微鏡下觀察，細胞膜呈現熒光的細胞，即為Smlg陽性細胞。同時用普通光源照明，計數該視野的淋巴細胞數，根據發熒光和不發熒光的淋巴細胞數，可求得Smlg⁺細胞或帶各類SmIg細胞的百分數。
（三）實驗材料
肝素抗凝血2ml，聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細胞分離液，FITC熒游標記的羊抗人Ig，Hanks液（含5%小牛血清），PBS、滅活的小牛血清、甲醇、緩衝甘油，水浴箱，熒光顯微鏡（應為落射光裝置）。
（四）實驗方法
1.用密度梯度離心法分離淋巴細胞。調整細胞濃度為2×10⁵~4×10⁵\/ml。
2.用溫(37℃)磷酸鹽緩衝液洗滌淋巴細胞至少3次，置37C水浴溫育1~，用以除去吸附的血清免疫球蛋白。
3.取細胞懸液加入PBS 1：4稀釋的熒光抗血清（含%NaNs)，冰浴20~30h。
4.用含% NaN₃的PBS洗滌3次。最後一次留少許PBS輕輕搖勻。
5.加1滴滅活的小牛血清，混勻後塗片，自然乾燥。
6.用甲醇固定10s後，用PBS沖洗1次。
7.加1滴緩衝甘油，在熒光顯微鏡下觀察結果。
（五）實驗結果
SmIg陽性細胞表面呈串珠狀、點狀、片狀或集中一端的帽狀熒光。計數時先計算一個視野內的熒光陽性細胞，再用可見光計數同一全部視野內的淋巴細胞總數，如此計算200個淋巴細胞求其Smlg陽性細胞的百分比。
B淋巴細胞百分率=Smlg⁺細胞數\/200×100%
參考值：通常人外周血Smlg陽性細胞為8%~15%，骨髓為60%，胸導管為18%，淋巴結為%~25%，脾為24%~35%，扁桃體為%。
（六）注意事項
1.為防止表面Ig遊動、脫落，測定中應保持低溫。同時，已熒光染色後的細胞應在短時間內固定檢查，如超過半天則計數結果顯著下降。
2.鏡檢時必須用油鏡計數，仔細區別淋巴細胞與中性粒細胞、單核細胞。
三、T細胞亞群分離技術
(一)流式細胞儀分離法
1.實驗目的
流式細胞儀分離T淋巴細胞，掌握T淋巴細胞分型方法，掌握流式細胞儀分離細胞的原則。
2.實驗原理
根據待分離的免疫細胞膜表面抗原的不同，製備出相應的熒游標記抗體，分離前，首先將待分離細胞製成單細胞懸液，經相應的熒游標記抗體染色後，進入流式細胞儀。此細胞儀以鐳射為光源，透過高速流動系統將樣品中的細胞排列成行， 一個一個地從流動室噴嘴處流出，形成細胞液柱。液柱與高速聚焦的鐳射束垂直相交，細胞受到鐳射激發後產生散射光併發射熒光，由光電倍增管接收光訊號並轉化成脈衝訊號，資料經電腦處理，分辨出細胞的型別，並對各型別分別計數和統計。同時，細胞根據其表面的電荷使液滴瞬間感應相應的帶電性，然後在電場的偏轉作用下進入不同的收集管，從而將各種免疫細胞分離。
用FACS(流式細胞儀)分離細胞準確快速，分選純度高(為99%)，不損傷細胞活性，可在無菌條件下進行，並可直接統計出各類細胞的相對含量。
3.實驗材料
抗CD₃、CD₄、CD₈的單克隆抗體， FITC—羊抗鼠IgG，正常小鼠 IgG ，細胞洗滌液(NaCl ，K₂HPO₄ ，KH₂PO₄ ，NaN₃ ，小牛血清20ml，加蒸餾水至 1000ml)，紅細胞裂解液(KHCO₃ ，NH₄Cl ，EDTA37mg，加蒸餾水至100ml)，固定液(25%戊二醛，葡萄糖，加無血清上述細胞洗滌液至 100ml)，肝素抗凝血，離心機、流式細胞儀等。
4.實驗方法
⑴取肝素抗凝血，分別加入4支小試管中(其中3 支為待測管，1支為對照管)各。然後在各待測管中分別加入抗CD₃、CD₄、CD₈的單克隆抗體(1:1000稀釋)，在對照管中加入正常小鼠IgG，30℃孵育45min。
⑵加入細胞洗滌液3ml，1000r\/min，離心2min。以洗去未結合的抗體，重複洗2次。
⑶搖勻管底沉澱細胞。加入 FITC-羊抗鼠IgG，30℃孵育45min。
⑷加入紅細胞裂解液3ml，見紅細胞懸液變為真溶液時，立即以1000r\/min離心2min。
⑸棄血紅蛋白上清液，用細胞洗滌液離心洗滌2次，每次1000r\/min離心2min。
⑹恢復體積至，加入固定液20μl。
⑺上機檢測。
5.實驗結果
流式細胞儀的檢測指標經計算機自動算出CD陽性細胞的百分率，並且將不同CD陽性細胞收集到不同試管進行分離。
(二)間接免疫吸附分離法
1.實驗目的
⑴掌握間接免疫吸附分離法分離丁細胞亞群的方法。
⑵掌握間接免疫吸附分離法的實驗原理，熟悉其實驗材料。
2.實驗原理
將總體T細胞與針對某種T細胞亞群的特異性鼠抗人單克隆抗體一起孵育，然後置入預先包被有羊抗鼠IgG的平皿中。此時結合有鼠抗人特異性抗體的T細胞亞群將被吸附在平皿中，而其他T細胞則不被吸附，由此即可將某一T細胞亞群從T細胞群體中分離出來。現介紹以抗CD8單克隆抗體將T細胞分為CD4⁺與CD8⁺細胞兩大類的具體方法。
3.實驗材料
羊抗鼠Ig，特異性鼠抗人CD8單克隆抗體或多抗，15mm×100mm塑膠平皿，已純化的T細胞懸液， \/L的Tris-HCl緩衝液、5%小牛血清的PBS、1%小牛血清的PBS，離心管、試管、吸管、離心機、倒置顯微鏡等。
4.實驗方法
⑴用 \/L的Tris-HCl緩衝液稀釋羊抗鼠Ig至10μg\/ml，加10ml至平皿中，室溫下孵育40min，或4℃下孵育24h，輕搖平皿使整個皿底均被抗體包被。（此平皿在4℃下可貯存1~2周)
⑵測定抗CD8單抗的最適使用濃度，並用PBS將抗CD單抗稀釋至該濃度。
⑶將2×10⁷~3x10⁷個T細胞置於15ml離心管中，在4~10℃下，以1300r\/min離心10min，棄上清液後，將抗CD8單抗加至T細胞中，懸浮細胞置冰浴30min。
⑷用吸管吸出平皿中未吸附的羊抗鼠Ig(可再用於包被平皿)，用含5%小牛血清的PBS 5~7ml洗滌平皿，輕輕搖動後吸出，重複洗滌3次。
⑸將含5%小牛血清的PBS 5~10ml加至T細胞中，在4℃下以1300r\/min離心10min，棄上清液，重複洗滌一次。用3ml上述液體懸浮T細胞。
⑹將T細胞懸液倒入上述經洗滌後的平皿中，立即置4℃下孵育30min，取出後輕搖30s，繼續在4℃下孵育30min。
⑺用吸管將未吸附的細胞懸液輕輕吸出，用含1%小牛血清的PBS輕輕洗滌平皿，洗滌時將吸管尖嘴抵住平皿的邊緣並緩慢滴加PBS，然後吸出，重複2~3次，將吸出的液體留置於另一試管中，以便分離未吸附的CD細胞。
⑻在倒置顯微鏡下檢查平皿，並對未吸附的殘留細胞計數，繼續洗滌，直至所有未吸附的CD細胞均被洗出。
⑼在平皿中加入5~7ml含1%小牛血清的PBS，用無菌刮匙輕輕刮下吸附的CD8⁺細胞，重複2~3次，或者加入15ml上述液體，用吸管猛烈吹打，將吸附的CD8⁺細胞洗下。
⑽分別將CD4⁺細胞與CD8⁺細胞懸液在4℃下，以1300r\/min離心10min，棄上清液，用完全RPMI-1640懸浮細胞，計數並調整細胞至所需濃度。
如果需提高細胞純度，可再重複(7)~(9)步。
5.思考題
⑴T、B淋巴細胞分離的方法最常用的是哪種？試說明其原因。
⑵流式細胞分離淋巴細胞有哪些優缺點？