實驗三 T淋巴細胞轉化試驗
細胞在體外培養時，受到非特異性有絲分裂原（如PHA、ConA)或特異性抗原刺激後，可出現代謝旺盛、蛋白質和核酸合成增加、細胞體積增大並能進行分裂的淋巴母細胞，此稱為淋巴細胞轉化現象。淋巴細胞轉化率的高低，可以反映機體的細胞免疫水平，因此，可作為測定機體免疫功能的指標之一。
淋巴細胞轉化試驗的方法有形態學方法、³H-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)摻入法及MTT比色法三種。
一、形態學方法
（一）實驗目的
1.掌握T淋巴細胞的有絲分裂現象。
2.掌握T淋巴細胞有絲分裂的原理和方法。
（二）實驗原理
T淋巴細胞在體外培養過程中受有絲分裂原如植物血凝素(PHA)等刺激後，可轉化為體積較大的母細胞，胞漿增多而深染，核增大並可見核仁，部分細胞可出現有絲分裂，計數轉化細胞的百分率可反映機體的細胞免疫功能。
附：淋巴細胞轉化的形態學特徵的階段性圖表
未轉化淋巴細胞，細胞的大小：6~9μm；核的大小：核較小、嗜鹼性強；染色質：緻密；核仁：無；胞漿：極少；胞漿內空泡：無。
過渡型淋巴細胞，細胞的大小：12~16μm；核的大小：核增大、嗜鹼性減弱；染色質：疏鬆；核仁：有或無；胞漿：增多，嗜鹼性；胞漿內空泡：有或無。
轉化型淋巴細胞，細胞的大小：12~20μm；核的大小：核大、嗜鹼性減弱；染色質：疏鬆可呈網狀；核仁：清晰，1~3個；胞漿：增多，嗜鹼性；胞漿內空泡：有或無。
（三）實驗材料
培養液（用前調至含小牛血清10%、青黴素100μg\/ml、鏈黴素100μg\/ml、穀氨酸胺\/L，用NaHCO₃調pH至~)。
(用RPMI-1640基礎培養液配成1000μg\/ml)。
\/L NH₄Cl。
4.吉姆薩染液。
5.固定液（甲醇與冰醋酸按9：1混合即可得到）。
6.離心機、恆溫箱、計數器及顯微鏡等。
（四）實驗方法
1.取無菌肝素抗凝血，加入細胞培養液中，同時加入PHA(1000g\/ml)，對照管不加PHA，將細胞置37℃、5%CO₂培養3天，每天搖動1次。
2.培養結束時吸棄大部分上清液，加入4ml NH₄Cl(\/L)混勻，置37℃水浴10min。
\/min，離心10min後棄去上清液，沉澱加5ml固定液，室溫下培養10min。
4.離心(2500r\/min，10min)後棄去上清液，等待，沉澱細胞製片，迅速吹乾。
5.吉姆薩染色10~20min，水洗，乾燥。
6.油鏡計數200個淋巴細胞中轉化的細胞數，計算轉化率。
（五）實驗結果
據上述形態學指標，計算出淋巴細胞轉化的百分率。
淋巴細胞轉化率(%)＝轉化的淋巴細胞數\/（轉化和未轉化的淋巴細胞總數）×100%
淋巴細胞轉化率能反映細胞免疫功能，正常值為60%~80%。
（六）注意事項
1.形態學計數法不需特殊裝置，沒有放射性汙染，一般實驗室均可採用。但判定結果受主觀因素影響較大，重現性較差，測定效率低，已逐漸被同位素摻入等方法所取代。
2.培養瓶的玻璃質量可影響轉化率，可選用中性玻璃小瓶（如鏈黴素或胰島素瓶）：培養瓶應有足夠的空間，一般10ml小瓶加2ml培養基較好。
二、³H-TdR摻入法
（一）實驗目的
1.掌握³H-TdR摻入法檢測淋巴細胞轉化的程度。
2.掌握³H-TdR摻入法的原理和方法。
（二）實驗原理
淋巴細胞在非特異性有絲分裂原（例如PHA）或特異性抗原刺激下轉化為淋巴母細胞，發生轉化過程中，細胞DNA合成大量增多。此時在細胞培養液中加入用同位素氚標記的胸腺嘧啶核苷(³H-Thymidine riboside，³H-TdR)，使³H-TdR摻入新合成的DNA中，根據摻入細胞內的同位素的量可判斷淋巴細胞轉化程度。
（三）實驗器材
培養液、小牛血清、2-巰系乙醇(2-ME)、青黴素、鏈黴素、Hanks液、PHA。
2.³H-TdR：將1mCi\/ml的溶液用無菌的生理鹽水稀釋成100uCi\/ml，4℃下儲存，臨用時再用培養液稀釋10倍成10uCi\/ml。
3.閃爍液：2，5-二苯基惡唑(PPO)5g，1，4-雙5-苯基惡唑基-2苯(POPOP) ，無水乙醇200ml，甲苯800ml，混勻即可。
%的三氯醋酸、無水乙醇。
孔培養板、CO₂培養箱、收集器、閃爍杯、49號纖維濾紙、離心管、各種吸管等。
（四）實驗方法
1.肝素抗凝人外周血2ml加Hanks液 4ml，混勻後緩慢加入含有2ml淋巴細胞分離液麵上，離心2000rpm\/min 20min，吸出混濁帶(內含單個核細胞) 加入含5ml Hanks 液試管中混勻，離心1000rpm\/min 10min，棄上清液，重複洗兩次，再加入1640培養液將細胞濃度調整至1×10⁶\/ml。
2.取上述細胞懸液加入到96孔培養板中，100μl\/孔，每個樣品新增6孔，其中3孔為實驗組，每孔加100μl PHA (10μg\/ml)，其他3孔為對照組，每個孔新增100μl RPMI-1640培養液。
3.置於37℃、5%CO₂培養箱中孵育48小時，每個孔加³H-TdR 20μl，繼續培養24小時。
4.用細胞收集器將每個孔的培養物分別吸收於濾紙之上。
5.將濾紙片吹乾後，分別將紙片浸入含2ml閃爍液的瓶中，並做好編號標記。
6.置於液體閃爍儀中測定每個樣品的每 min脈衝數 (cpm)。
（五）實驗結果
1.根據所測得的cpm值(取每份標本的三份復孔的平均值)換算成△cpm、刺激指數(SI)或相對轉化指數(RPI)。計算公式為：
△cpm= 實驗組cpm - 對照組cpm。
刺激指數(SI)＝實驗組cpm\/對照組（未刺激）cpm。
相對轉化指數 (RPI)=實驗標本△cpm\/三個以上正常標本的平均△cpm。
值隨著對照組的變化而變化，與△cpm和RPI相關性較差；而RPI值優於SI值，代表待測標本與正常群體的比值。用這種方法計算，要收集至少10個正常人的大量淋巴細胞，分裝、低溫儲存，每次取出其中三份正常細胞作為對照。若要動態觀察病情情況，可每次都取同樣的三份正常細胞作為對照組，用以避免實驗誤差。用對照組的細胞所測得的正常人RPI在~之間，而90%以上的人的RPI在~之間。
（六）注意事項
1.³H-TdR 加入的時間：在細胞分裂週期中，只有S期合成DNA，故在S期加入³H-TdR，加入過早不但不能被細胞攝取反而會被降解為胸腺嘧啶，不能作為合成DNA的原料。一般在培養終止前6小時或16小時加入³H-TdR，其摻入量較高。
2.³H-TdR需要準確加樣，嚴格控制實驗條件。
3.沖洗、抽濾去除未摻入細胞內的³H-TdR要充分。
（七）實際應用
1.可作為先天性免疫缺陷的評價和監控。
2.可作為免疫抑制和免疫增強的治療效果的評價。
3.可用於檢測機體對各種抗原、變應原或病原體的致敏情況。
三、MTT 比色法
（一）實驗目的
1.掌握MTT比色法的實驗原理和實驗方法。
2.掌握淋巴細胞轉化程度的計算方法。
（二）實驗原理
MTT[3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl) -2，5-diphenyltetrazoliumbromide]是黃色可溶性物質，細胞活化增殖時透過線粒體能量代謝過程，將MTT代謝形成藍紫色的甲瓚(formazan)沉積於細胞內或細胞周圍，形成的甲瓚(formazan)的量與細胞活化增殖的程度成正比。甲瓚(formazan)經異丙醇溶解後呈紫藍色，根據顯色程度即可知道甲瓚(formazan)量和反應細胞活化增殖情況。
（三）實驗材料
培養液、小牛血清、2-巰系乙醇(2-ME)、青黴素、鏈黴素、刀豆蛋白A(ConA)、Hanks液、~ PBS緩衝液。
(5mg\/ml，用\/L、的PBS緩衝液臨用時配製)。
\/L HCL-異丙醇(臨用時配製)。
4.酶標儀、96孔細胞培養板等。
目篩網、24孔培養板、手術器械、CO₂培養箱、培養瓶、離心管、各種吸管等。
（四）實驗方法
1.無菌條件下取脾，置於盛有10ml無菌的Hanks液的離心管中，然後倒入無菌的小平皿中，用注射器芯將脾磨碎，製成單細胞懸液，經200目篩網過濾，用Hanks液洗2次，每次離心1000rpm\/min，再加入1640培養液將細胞濃度調整至5×10⁶\/ml。
2.取上述每一份脾細胞細胞懸液加入24孔培養板中，其中實驗孔加，對照孔加，再在實驗孔中加30μg\/ml的ConA ，對照孔加完全培養基，混勻後置於37℃、5%CO₂培養箱孵育72小時。
3.培養結束前4小時，每孔輕輕吸上清液700μl，加入700μl不含小牛血清的1640培養液，同時加入MTT(5mg\/ml)50μl\/孔，混勻後繼續培養4小時，每個孔加1ml的鹽酸異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解，然後分裝到96孔培養板中，每個孔做3個平行孔，放置於酶標儀內（波長分別為570nm和630nm)測定OD值。
（五）實驗結果
以刺激指數(SI)判斷淋巴細胞轉化程度：
SI=實驗組OD（570-630）值\/對照組OD（570-630）值
（六）注意事項
1.加入鹽酸異丙醇後要在1小時內進行測定，若1小時內不能測定，可將未加鹽酸異丙醇的培養板置4℃儲存，測定前取出，室溫放置數min後再加鹽酸異丙醇，依上法測定。
的濃度很重要，過低不能刺激足夠的細胞增殖，過高會抑制細胞增殖，不同批號的ConA在實驗前要進行預實驗，以找到最佳濃度。
（七）實際應用
1.移植中組織相容性抗原配型。
2可用於檢測血清中的增強或抑制因子，同時還可以檢測淋巴因子和T抑制細胞的作用。
（八）思考題
1.檢測T淋巴細胞轉化試驗的方法哪種最靈敏？
2.試比較上文中三種檢測方法各有何優缺點。
不知道為什麼總是被卡稽核，好難寫啊，還總是莫名其妙被判。(＞﹏＜)(＞﹏＜)