層析技術是近代生物化學常用的分離分析技術之一。層析系統有兩相，一是固定相，一個是流動相。當流動相流過有樣品的固定相時，由於樣品各組分的理化性質（如吸附力，分子形狀和大小、分子極性，分子親和力、分配係數等）的差別，受固定相的阻力和流動相的推力的影響不一，從而以不同速度移動而得以分離。
層析技術於1903年由俄國植物學家茨維特首先用於分離植物色素。他利用吸附劑對不同顏色色素吸附能力的不同將混合色素在吸附柱上分離成不同的色素層，因此也稱“色層分離法”、“色譜法”。以後逐漸發展到應用於無色物質的分離純化，分離機制也不僅限於吸附。
根據層析系統的各種特徵，可將層析法分成不同型別，固定相可以裝入柱中，展成薄層或塗成薄膜，稱為色譜床。流動相可以是氣體，也可以是液體，分別稱為氣相色譜和液相色譜。
分類依據：兩相狀態；型別：氣液，氣固液液，液固，液凝膠。
分類依據：床的幾何形狀；型別：柱式：填充柱，空管柱；開床式：濾紙，薄層。
分類依據：展開方式；型別：洗脫，迎頭，置換。
分類依據：分離機制；型別：吸附，分配，離子交換，凝膠過濾，親和，其他。
下面簡要介紹吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析與親和層析。
(一)吸附層析
吸附層析是指混合物隨流動相透過由吸附劑組成的固定相時，由於吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分得以分離的方法。
吸附力的強弱除與吸附劑及被吸附物質本身的性質有關外，也和所處溶液的組成密切相關。
當改變流動相的溶劑成分，使吸附力下降時，被吸附物則從吸附劑上解吸下來，這種解吸過程亦稱為洗脫或展層。經過在吸附劑與洗脫液之間的吸附—解吸附再吸附—再解吸附的反覆過程，使被吸附物沿流動相前進方向移動，最後因吸附力不同故移動速度不同而使各組分逐漸分開。
常用的吸附劑有氧化鋁、矽膠、活性碳、碳酸鈣等，其中氧化鋁、矽膠、碳酸鈣是親水性的，含水量越高，其吸附能力越弱，所以使用前要在一定條件下加熱以除去水分，這個過程稱為活化。
根據操作方式的不同，吸附層析又分為柱層析與薄層層析：
1.柱層析：柱層析是在玻璃管柱底鋪墊細孔尼龍網或玻璃棉，管內裝入吸附劑，用適當溶劑溼潤後將欲分離的樣品溶液從柱頂加入，使液體緩慢向下流過層析柱。待樣品液全部流入柱內的吸附劑後，溶質即被吸附在柱上（柱中吸附劑上），再加入適當的洗脫液，使被吸附的物質逐步解吸而隨洗脫液向下移動。由於各組分受吸附劑的吸附力與洗脫液（溶劑）的溶解力不同而以不同的速度移動，最後逐漸分開。如被分離物質繫有色物質，就能清楚地看到色層；如被分離物無色，可用其它方法顯色，繼續洗脫並分部收集洗脫液，即可得到分離的各組分溶液。
對洗脫劑的要求是純度合格，與樣品各組分及吸附劑不起任何化學反應，對樣品溶解度要大，黏度要小，易與被洗脫組分分開。
本法適用於非極性或極性弱的有機物如甘油脂、磷脂、膽固醇、色素等的分離。
2.薄層層析：薄層層析法是將吸附劑在玻璃板上均勻地鋪成薄層，再把要分析的樣品點在薄層板的一端，然後把點樣端浸入適當溶劑展層、透過一定時間的吸附與解吸附的反覆運動即可使樣品中各組分分離開來。
薄層層析由於操作便捷、快速、靈敏、分離效果好、顯色容易而被廣泛應用，但對生物大分子的分離效果不夠理想。
(二)分配層析
分配層析是利用混合物中各組分在兩相中分配係數不同而使物質分離的層析技術，相當於一種連續性的溶劑萃取方法。
分配係數是指在一定溫度和壓力條件下，某一溶質在相互接觸而互不相溶的兩種液劑中的溶解達到平衡時，該溶質在兩相溶劑中的濃度比。用下式表示，分配係數K＝Cᴀ\/Cʙ，式中Cᴀ為溶質在溶劑A中的濃度，Cʙ為溶質在溶劑B中的濃度。
在同一溶劑體系中，不同物質的分配係數往往都不相同，這就是用有機溶劑從水溶液中提取分離某些溶質（萃取）的依據。
在分配層析中，固定相是結合在惰性多孔支援物上的極性溶劑（如吸在濾紙上的水），流動相則來用極性小或非極性的有機溶劑。分配係數就是指達到平衡時，物質在固定相和流動相的濃度比值。
分配係數K＝物質在固定相的濃度Cʙ\/物質在流動相的濃度Cₘ
分配係數較大的物質，在固定相停留時間較長而移動速度較慢；分配係數較小的物質則相反。
紙層析是最廣泛應用的一種分配層析，它已成為生化研究中的一項重要的分離分析技術，對氨基酸、肽類、核苷及核苷酸、糖、維生素等小分子物質的分離鑑定十分有用。
紙層析是以紙為惰性支援物。濾紙纖維和水有較強的親和力，能吸附22%左右的水，有機溶劑的親和力很弱。所以水被濾紙吸附成為固定相，某些有機溶劑如醇、酚等為常用的流動相。當流動相溶劑透過毛細管作用沿濾紙流經樣品點時，樣品溶質就在水相（固定相）與有機相(流動相)之間進行分配，一部分溶質離開原點隨有機相移動，進入前面的固定相時，按分配係數重新進行分配，一部分轉入固定相。當有機相不斷流動時，溶質就不斷進行分配，沿著有機相流動方向移動，由於各種溶質在同一層析體系中分配係數不同，因而移動速度不一，經一定時間的持續流動和再分配後，分配係數不同的物質即可彼此分開。溶質的移動速度可用比移值Rf表示：Rf＝原點到層析斑中心的距離\/原點到溶劑前沿的距離。
在紙層析中，Rf值的大小主要決定於該溶質的分配係數，不同物質因分配係數不同，R也不同，相同的物質在同一層析系統中的R值是相同的，所以可根據測量出來的R值參照標準物的R值來判斷層析分離的各種成分。
紙層析法按操作方式分垂直型與水平型兩種，垂直型的展開方式有上行與下行法兩種。在上行法中，平衡後將濾紙條或捲成的濾紙圓筒懸掛，讓濾紙下端與溶劑接觸。樣品點必須高於溶劑面。當溶劑由下而上過點樣點垂直擴散時而完成樣品的分離。在下行法中，將點樣的一端壓在一個盛有展層溶劑的槽內，使濾紙垂直懸掛，溶劑自上而下移動而使樣品各組分分離。上行法因安裝方便而常被採用。水平型常採用環行展層，如圓形濾紙層析。將樣品點放在距離圓心1cm的對稱位置上，將濾紙水平放置，溶劑由中央小孔所插的“燈芯”吸引上升。出中央向四周呈輻射狀擴散。
上述方法只用一種溶劑系統進行一次展層，故稱單向層析。如果樣品成分較多，而且彼此的R值又相近時，單向層析尚不能將其分開，可採用雙向層析法。所謂雙向層析即在長方形或正方形濾紙的一角點樣，捲成圓筒形，先用第一種溶劑系統展層，然後取出吹乾，將濾紙旋轉90°，再用另一溶劑系統，向另一方向進行第二次展層，則可將第一次層析斑點中的混合成分再度分離。
(三)凝膠層析
凝膠層析或稱凝膠過濾，是利用有一定孔徑範圍的多孔凝膠作為固相，對混合物中的各組分按分子量大小進行分離的層析技術，所以又叫分子篩層析。當樣品溶液流經這類凝膠的層積柱時，各組分因分子量不同，受凝膠網孔阻滯的程度不同，從而以不同的速度透過層析柱。分子量較大的物質，因不能或較難透過網孔進入凝膠顆粒，只是沿著膠粒之間的間隙流動，所以受阻遊的程度較小，流程較短，向前移動速度較快，最先流出層析柱；反之，分子量較小的物質因顆粒直徑小，可不同程度經網孔進入膠粒內。當它們向下移動時，必須等待它們從凝膠內擴散出來再進入另一凝膠顆粒內，如此不斷進入和擴散，故受阻帶的程度較大，小分子物質流程長，向前移動速度慢，從而流出層析柱的時間較遲。由於層析過程中這種阻作用的差異使物質得以分離，所以這種層析方法稱為阻滯擴散層析或排阻層析。
多孔膠內部和膠粒間存有大量液體，所以層析柱中膠床的總體積(Vₜ)是凝膠顆粒基質本身的體積(Vg)和凝膠顆粒內體積（內水體積Vᵢ)及顆粒間隙體積（外水體積Vₒ)的總和。即：Vₜ＝Vₒ+Vᵢ+Vg。
如果被分離物質分子很大，完全不能進入膠粒網孔內。那麼它從柱上完全洗脫下來所需的洗脫液體積(Ve)就等於膠粒間隙的體積，即Ve＝Vₒ；另一種極端的情況是分子極小，可以非常自由地經網孔進出膠粒，那麼它的洗脫體積Ve＝Vₒ+Vᵢ；分子大小在上述兩者之間的，洗脫體積應在Vₒ到(Vₒ+Vᵢ)之間。所以，分子大小不同的物質，它們的洗脫體積不同，從而可用於物質的分離；另一方面，分子量和洗脫體積有關，所以在有適當已知分子量的標準物質作比較的前提下，就可以根據洗脫體積來估計物質的分子量。
由於凝膠層析裝置簡單，操作方便、快速、重複性好，樣品回收率幾乎高達100%，而且條件溫和，一般不引起生物樣品的變性失活，因此廣泛用於各種生物成分的分離提純、脫鹽、濃縮及組成成分分析等。
適用於凝膠層析的材料要求具備如下條件：化學性質穩定，不帶電荷，與物質的吸附能力極弱，能製成多孔網狀結構且機械效能好，不易破碎變形，最好呈大小均勻的圓珠狀，以保證有較高的流速。常用的有人工合成的葡聚糖凝膠（商品名sephadex)、聚丙烯醯胺額膠（商品名bio-gel-p）和天然的瓊脂糖凝膠(agarosegel)(商品名sepharose)。
交聯葡聚糖凝膠的基本骨架是葡聚糖，由許多右旋葡萄糖迅過1,6-糖苷鍵聯成鏈狀結構，再由一種交聯劑表氯醇（即1-氯-2,3-環氧丙烷）形成醚橋交聯的立體多孔海綿狀結構。交聯度越大，網孔越小；交聯度越小，網孔越大。
凝膠產品都因網孔大小不同而分為若干型號，適用於分子在一定範圍內的物質的分離。
聚丙烯酸胺凝膠的技術資料
型號：Bio-gel-p-2
排阻的下限（分子量）：1600，分級分離的範圍（分子量）：200-2000，膨脹後的床體積（毫克\/克凝膠）：，膨脹所需最少時間（室溫\/小時）2-4小時。
排阻的下限（分子量）：3600，分級分離的範圍（分子量）：500-4000，膨脹後的床體積（毫克\/克凝膠）：，膨脹所需最少時間（室溫\/小時）2-4小時。
排阻的下限（分子量）：4600，分級分離的範圍（分子量）：1000-5000，膨脹後的床體積（毫克\/克凝膠）：，膨脹所需最少時間（室溫\/小時）2-4小時。
排阻的下限（分子量）：10000，分級分離的範圍（分子量）：5000-17000，膨脹後的床體積（毫克\/克凝膠）：，膨脹所需最少時間（室溫\/小時）2-4小時。
排阻的下限（分子量）：30000，分級分離的範圍（分子量）：20000-50000，膨脹後的床體積（毫克\/克凝膠）：，膨脹所需最少時間（室溫\/小時）10-12小時。
排阻的下限（分子量）：60000，分級分離的範圍（分子量）：30000-70000，膨脹後的床體積（毫克\/克凝膠）：，膨脹所需最少時間（室溫\/小時）10-12小時。
排阻的下限（分子量）：100000，分級分離的範圍（分子量）：40000-100000，膨脹後的床體積（毫克\/克凝膠）：，膨脹所需最少時間（室溫\/小時）24小時。
排阻的下限（分子量）：150000，分級分離的範圍（分子量）：50000-150000，膨脹後的床體積（毫克\/克凝膠）：，膨脹所需最少時間（室溫\/小時）24小時。
排阻的下限（分子量）：200000，分級分離的範圍（分子量）：80000-300000，膨脹後的床體積（毫克\/克凝膠）：，膨脹所需最少時間（室溫\/小時）48小時。
排阻的下限（分子量）：300000，分級分離的範圍（分子量）：100000-400000，膨脹後的床體積（毫克\/克凝膠）：，膨脹所需最少時間（室溫\/小時）48小時。
(四)離子交換層析
離子交換層析是以離子交換劑為固定相，利用其對需要分離的各種離子結合力的差異而將混合物中不同離子進行分離的層析技術。
離子交換劑是一類具有特殊網狀立體結構的高分子多元酸或多元鹼聚合物，不溶於水和許多有機溶劑。聚合顆粒中帶電荷的酸性或鹼性基團作為離子交換基團，透過靜電作用與帶相反電荷的離子（反離子）結合。當流動相中存在其他帶相反電荷的離子時，就與先結合在固相交換基團上的反離子進行交換。根據可交換離子的性質，離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑兩大類。陽離子交換劑分子中具有酸性基團，能和流動相中的陽離子進行交換。例：R-SO₃⁻H⁺+Na⁺⇆R-SO₂⁻Na⁺+H⁺。陰離子交換劑分子中具有鹼性基團，能和流動相中的陰離子進行交換。如：R-N⁺(CH₃)₃OH⁻+CI⁻⇆ R-N⁺(CH₃)₃CI⁻+OH⁻。（注：⇆應改為可逆符號，但是沒找到，只能用⇆代替了）
流動相中不同離子化合物帶電荷多少不同，與離子交換劑相互作用的強弱也不同。當它們被結合到固定相交換基團上後，可以用提高流動相中的離子強度或改變pH的辦法，把它們從離子交換柱上依次洗脫下來，達到分離純化的目的。
常用的離子交換劑為人工合成的有機物，包括離子交換樹脂、離子交換纖維素和離子交換葡聚糖等。根據交換基團酸鹼性的強弱，陽離子交換劑又分為強酸型和弱酸型，陰離子交換劑又分為強鹼型和弱鹼型。在實際工作中，可根據被分離物的性質選用適當型別的離子交換劑。如按甲基纖維素(CM-纖維素)常用來分離中性或鹼性蛋白質：二乙氨基乙基纖維素(DEAE-纖維素)常用來分離中性或酸性蛋白質；而離子交換樹脂常用於分離小分子物質如氨基酸、核苷、核苷酸等及製備去離子水。
(五)親和層析
親和層析是以能與生物高分子進行特異結合的配基作為固定相、對混合物中某一生物高分子進行分離純化的層析技術。
生物高分子具有能與其給相對應的專一分子進行可逆結合的特性，如：酶與底物、產物、輔酶、抑制劑和變構調節劑結合；激素與受體社合；抗原與相應的抗體結合，RNA與互補的DNA結合等等。把作為配基的專一分子（如酶的底物、輔酶，抗原的互補抗體）與共價鍵連線到不溶性載體（如纖維素，葡聚糖凝膠）上使之固相化，然後將固相化的載體裝入層析柱，作為層析的固定相，把含有一種或數種生物高分子（如蛋白質）混合液加到柱上，這時混合物中只有能與不溶性配基具有高度親和性的蛋白質被吸留，其他不能與配基結合的蛋白質則不受阻礙地直接從柱中流出。再用緩衝液洗盡黏附在配基表面的非親和吸附物，以改變洗脫液，把特異吸附的蛋白質從不溶性配基上解離和洗脫下來。
親和層析具有特異、簡使、快速等優點，對分離含量最極少又不穩定的生物高分子非常有效。